榄香烯乳对大肠癌HCT116细胞侵袭及miR155表达影响.docVIP

榄香烯乳对大肠癌HCT116细胞侵袭及miR155表达影响 　　[摘要]　目的　观察榄香烯乳对人大肠癌细胞迁移、侵袭的影响，并探讨其可能机制。　方法　采用不同浓度的榄香烯乳处理人大肠癌HCT116细胞后，以划痕试验方法检测癌细胞迁移能力，以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力，采用荧光实时定量PCR方法检测癌细胞miR-155　mRNA水平。　结果　人大肠癌HCT116细胞经榄香烯乳处理后，迁移和侵袭力均明显下降，且呈剂量依赖性（P　　0.05）。榄香烯乳处理组miR-155　mRNA水平明显下调，且呈浓度依赖性。　结论　榄香烯乳可降低人大肠癌细胞侵袭能力，下调miR-155　mRNA表达是其重要机制之一。 　　[关键词]　大肠肿瘤；榄香烯乳；侵袭力；miR-155 　　[中图分类号]　R735.3+4 [文献标识码]　A [文章编号]　1674-4721（2012）12（a）-0007-03 　　近年来，国内大肠癌发病率逐渐增高，寻找有效的治疗药物和治疗手段乃当务之急。榄香烯乳（elemene）是从中药温莪术提取的有效成分之一，临床应用已显示其具有较广泛的抗癌谱[1-5]。但是榄香烯乳调控癌细胞侵袭的分子机制尚不完全清楚。本课题组以大肠癌HCT-116细胞为模型，探讨了榄香烯乳对癌细胞迁移、侵袭的效应，并从micro　RNA（miRNA）角度探讨其分子机制。 　　1　材料与方法 　　1.1　实验材料 　　榄香烯乳，购自华立金港制药有限公司；人大肠癌细胞系HCT-116，本院组织细胞生物库冻存；RNA提取试剂TriIzol购自美国Invitrogen公司；基底膜胶（Matrigel）购自BD公司；RPMI　1640、胎牛血清均购自Gibco公司。 　　1.2　实验方法 　　1.2.1　细胞培养及药物处理 人大肠癌HCT-116细胞置于含5%胎牛血清的RPMI-1640液中，在37°C　CO2培养箱中常规培养。待细胞至对数生长期，采用不同浓度（10、20、40　μg/mL）的榄香烯乳处理，以RPMI-1640代替榄香烯乳处理细胞作为空白对照组，3复孔，备测。 　　1.2.2　癌细胞迁移检测 采用划痕法检测癌细胞迁移能力，具体步骤参照文献[6]方法进行。基本操作步骤如下：（1）先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5～1.0　cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。（2）同样方法培养细胞至对数生长期，消化、计数，使用培养基配制成浓度为8×105个/mL的细胞悬液，　6孔细胞培养板中每孔加入1　mL细胞悬液，放入37℃，5%CO2培养箱中培养直至细胞铺满单层。（3）用100　μL枪头沿培养板底部呈“一”字形划痕；用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。（4）弃去培养基，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，用培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入1　000　μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组。（5）6孔细胞培养板置于37℃　5%CO2培养箱中培养24　h，拍照。 　　1.2.3　细胞侵袭检测 该试验在Transwell板上进行，具体步骤参照文献[7-8]方法进行。倒置显微镜（×100）观察穿过膜的细胞数。每张膜中央部分和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内穿过聚碳酸酯膜微孔的细胞数。 　　1.2.4　miR-155　mRNA水平检测 采用荧光实时定量PCR检测。采用Trizol方法抽提细胞总RNA抽提，采用试剂盒逆转录为cDNA。miR-155　定量PCR上游引物：5′-CGCGCTTAATGCTAATCGTGA-3′；下游引物：5′-　GTGCAGGGTCCGAGGT　-3′，大小为62　bp。内参GAPDH上游引物：5-　CATCTTCTTTTGCGTCGCCA　-3′；下游引物：5′-　TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC　-3′，大小为115　bp。循环条件及计算方法参照文献[9]进行。 　　1.3　统计学方法 　　采用SPSS　17.0统计软件包进行统计学处理，所得到的数据均以均数±标准差表示，P　　0.05为差异有统计学意义。 　　2　结果 　　2.1　榄香烯乳对大肠癌细胞迁移的影响 　　采用划痕法观察榄香烯乳对癌细胞迁移的影响。与对照组癌细胞（图1A）比较，榄香烯乳处理组癌细胞迁移速度较慢，迁移距离明显低于空白对照组（图1B），后者划痕两侧癌细胞已趋融合。 　　2.2　榄香烯乳对大肠癌细胞侵袭的影响 　　收集经榄香烯乳处理的HCT116细胞，采用Transwell检测癌细胞侵袭情况。对照组、不同浓度（10、20、40　μmol/L）　榄香烯乳处理组穿过滤膜的细胞分别为（43.8±1.7）、（31.6±1.6）、