生物传感芯片界面免疫反应动力学研究.docVIP

生物传感芯片界面免疫反应动力学研究 　　摘 要：近年来，具有高亲和性和特异性的免疫反应在生物化学分析、食品安全和环境监测领域得到越来越广泛的应用，抗体-抗原亲和反应分析方法的研究显得尤为重要。本文基于平面波导生物传感器，研究芯片界面抗体-抗原间的相互作用。通过共价结合将包被抗原结合在芯片表面，制备了可重复使用20次的免疫芯片，研究芯片表面的免疫反应动力学，建立芯片表面的荧光免疫动力学方程，获得了相应的免疫亲和参数。 　　关键词：平面波导；荧光免疫；动力学分析；抗体-抗原反应 　　0 引言 　　近年来，具有高亲和性和特异性的免疫反应在医学诊断、生物化学分析、食品安全和环境监测领域得到越来越广泛的应用[1，2]，抗体-抗原亲和反应的定性或定量分析方法的研究显得尤为重要。传统的分析方法有热量测定法、电泳分析法、超速离心分析法，但这些方法仅适用于低通量分析，且结果分辨率较差。为了克服传统方法的缺点，光学生物传感器开始应用于免疫反应动力学研究，如SPR[3]、BLI[4，5]、光波导生物传感器[6]，这些技术可以实现实时的动力学反应数据分析，并且更加快速和灵敏[7-11]。 　　本文基于平面波导生物传感器建立了一种分析芯片界面抗体-抗原免疫反应动力学的方法。该方法研究了芯片表面包被抗原与溶液中单克隆抗体的免疫反应，并得到了芯片界面免疫反应的结合速率、解离速率和亲和常数。本文主要选取了三聚氰胺、黄曲霉素M1、磺胺二甲嘧啶和双酚A这四种物质的单克隆抗体-抗原反应作为研究对象，研究了在芯片界面的免疫反应动力学，为基于免疫反应的检测研究提供了数据支持和理论依据。 　　1 试验材料和方法 　　1.1 试验材料 　　试验中使用的材料主要包括如下：BSA（Sigma），三聚氰胺（Mel）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、双酚A（BPA）和黄曲霉四M1（AFM1）单克隆抗体，BSA-Mel，BSA-AFM1，BSA-BPA，BSA-SM2，GMBS（Sigma），Cy5.5-NHS（GE），MTS（Sigma），10mM PBS，100mM PBS，H2SO4，30%H2O2，SDS，HCl，NaOH。 　　1.2 免疫芯片的制?? 　　本试验利用MTS和GMBS在芯片表面固定包被抗原。反应流程如图1所示。主要步骤如下：a.芯片表面羟基化[12]：将干净的芯片浸泡在piranha溶液中（浓H2SO4/ 30%H2O2体积比为3：1），在110℃下反应60min；b.芯片表面硅烷化：用无水甲苯配置2%的MTS溶液，将芯片置于其中反应2个小时；c.引入偶联基团：首先将芯片置于无水乙醇配置的2mM的GMBS溶液中，反应1个小时；d.包被抗原的固定：将15μl0.5mg/ml被抗原滴在芯片的全反射位点上。在温度为4℃的条件下反应12小时后，用超纯水清洗残留包被抗原，随后用2mg/ml的BSA溶液封闭芯片表面未反应的活性基团。未测验时，免疫芯片保存于4℃冰箱，保持芯片表面清洁。 　　1.3 平面波导生物传感器 　　本研究组自主研发了平面波导生物传感器，该传感器主要基于倏逝波和全内反射荧光原理（TIRF）[13，14]，利用全内反射产生的倏逝波激发芯片表面数百纳米薄层内的荧光基团，从而产生荧光信号，传感器采用光纤收集荧光信号，再通过光电转换器将荧光信号转换为电信号，从而实现定量分析。利用平面波导生物传感器定量分析目标物质，就必须设计巧妙的方法将目标物质的浓度与荧光信号的强弱建立正相关或者负相关的关系。 　　该生物传感器主要由传感元件、自动进样系统、光学分析系统和信号处理系统4个部分组成，如图2所示。 　　1.4 实验方法 　　将固定了BSA-Mel、BSA-BPA、BSA-SM2和BSA-AFM1的生物芯片置于平面波导生物传感器的反应池。所有反应都在10mM PBS缓冲体系中进行。为了获得动力学结合数据，通入不同浓度的抗体混合液（含有Ab-Mel-Cy5.5、Ab-AFM1-Cy5.5、Ab-SM2-Cy5.5和Ab-BPA-Cy5.5四种标记荧光的抗体）与芯片反应，获得不同时间条件下的信号强度。每次反应结束后，用0.5% SDS（pH为1.9）的缓冲溶液打断抗体和芯片表面抗原之间的化学键，同时保持芯片表面抗原的活性，实现芯片的重复使用，节省成本的同时，还能保证结果的一致性。 　　1.5 反应动力学和亲和性分析 　　抗体和抗原的特异性主要由抗原决定簇的空间位置决定。抗体在任何一个系统中都有一个有限的亲和性，可用解离常数KD（单位为M）来表示，KD是解离速率（kd，s-1）与结合速率（ka，M-1s-1）的比值[15，16]： 　　KD=kd/ka （1） 　　抗体与抗原的反应关系可用以下的关系式来表示： 　　（2） 　　其中，A