猪传染性胃肠炎病毒RT―PCR诊断方法建立与应用.docVIP

猪传染性胃肠炎病毒RT―PCR诊断方法建立与应用 　　摘要 为建立一种快速简便的检测猪传染性胃肠炎的RT-PCR方法，根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒N蛋白基因的核苷酸序列设计1对引物，并以合成的cDNA为模板，初步建立了猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR检测方法，进而对对照病毒及采集的病料组织进行了敏感性、特异性和重复性检测。结果表明，该研究建立的RT-PCR方法敏感性高，最低核酸检测值为0.5ng/μL，扩增产物特异性好，重复性稳定，可应用于猪传染性胃肠炎病毒的实验室诊断和流行病学调查。 　　关键词 猪传染性胃肠炎病毒；RT-PCR；诊断；流行病学调查 　　中图分类号 S858.28 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）04-229-02 　　猪传染性胃肠炎是一种高度接触性传染病[1]，由猪传染性胃肠炎病毒感染引起，可以感染任何年龄段的猪，对15日龄左右的仔猪的危害最大，死亡率可达100%。5周龄以上的仔猪感染发病后死亡率较低，但会影响其后期生长发育，降低饲料利用率[2]。1946年美国学者首次报道猪传染性胃肠炎，我国于1964 年首次分离到TGEV[3]，直到目前，我国大部分地区都存在该病毒。TGEV患病猪出现水样腹泻、脱水等主要症状，多发于冬春寒冷季节，目前仍是造成仔猪发病和死亡的主要疫病之一，给养殖业造成极大损失。 　　本研究根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒核衣壳蛋白基因（N基因）的核苷酸序列设计1对引物，建立了一种RT-PCR诊断方法，将本实验室收集到的临床病例组织病料和对照病毒为研究对象，对诊断方法进行验证。结果表明，建立的RT-PCR诊断方法快速、准确、敏感，有助于猪传染性胃肠炎的流行病学调查研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验病料及对照病毒 　　收集2012―2014年广西9个地市58个猪场疑似仔猪腹泻的仔猪肠系膜淋巴结或肠样粪便样品506份；对照病毒TGEV和PEDV为中牧实业股份有限公司生产的猪传染性胃肠炎、猪传染性胃肠炎二联活疫苗（HB08株+ZJ08株，批号为1706004-2），CSFV和HP-PRRSV为广东永顺生物制药股份有限公司生产的猪瘟活疫苗（传代细胞源，批号为2016023），高致病性猪繁殖与呼吸综合征（GDr180株，批号为2017004）；口蹄疫O型、A型、亚洲I型抗原购自兰州兽医研究所。 　　1.2 主要?剂 　　主要试剂包括RNA酶抑制剂、M-MuLV反转录酶、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶、MgCl2，购自宝生物工程（大连）有限公司，以及Trizol、氯仿、异丙醇等。 　　1.3 引物设计 　　根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒N蛋白基因的核苷酸序列，利用Oligo 6.0引物设计软件设计了针对TGEV N基的诊断引物。基因序列如下，TGEV-N1：5′-CCA-ACGTAAAGAGCTTCCTGA-3′，TGEV-N2：5′-TTGCTGTTG-TTTTTCTGTGTC-3′，预期目的片段大小为388 bp。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。 　　1.4 样品处理及总RNA的提取 　　将病料组织剪碎并研磨，以1∶5的体积比的量加入灭菌PBS（pH=7.2）混匀，制成悬液。-20℃反复冻融3次，于4 ℃ 8 000 r/min 离心10 min，取上清液，过0.22 μm一次性滤膜后冰冻于-70℃冰箱备用。取300 μL上述上清液于1.5 mL无RNA酶离心管中，采用Trizol法提取总RNA，每管加入500μL Trizol混匀，于室温下作用10 min，加入160 μL氯仿，于室温下作用3 min；于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；吸取400 μL上清液，加入等体积异丙醇混匀，于室温下作用10 min；于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入1 mL 75%乙醇，8 000 r/min离心5 min；弃去乙醇，超净工作台中自然晾干，加入30 μL 0.1%DEPC水并于55～60 ℃中孵育即可得到病毒总RNA。其他对照病毒的总RAN参照以上方法获得。 　　1.5 cDNA合成 　　cDNA的合成采用25 μL体系，其中含5×buffer 5.0 μL，终浓度为1×；200 U/μL M-MuLV反转录酶0.5 μL，终浓度为4 U/μL；40 U/μL RNA酶抑制剂0.5 μL，终浓度为0.8 U/μL；10 mmol/L dNTP混合液2 μL，终浓度为0.8 mmol/L；50 μmol/L TGEV-N2 1 μL，终浓度为2 μmol/L；病毒总RNA16 μL。 　　1.6 PCR反应 　　PCR反应采用25