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猪卵巢采集月份保存温度及时间对其卵母细胞体外成熟影响 　　摘要：为了探讨猪卵巢采集月份、保存温度及保存时间对卵母细胞体外成熟的影响，对不同月份、不同保存温度及不同保存时间的猪卵巢采用抽吸法获得卵丘卵母细胞复合体（COCs），体外培养统计其第一极体排出情况。结果表明，从屠宰场所取卵巢的COCs数5～7月和8～10月期间显著（P0.05），但是存放在30和35 ℃的生理盐水中的卵巢的卵母细胞体外成熟率极显著（P0.05），但存放2 h的卵巢的卵母细胞体外成熟率显著（P0.05）高于存放4、6和8 h的。 　　关键词：猪卵巢；卵母细胞；月份；温度；时间；体外成熟 　　中图分类号：S828.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5805-03 　　猪卵母细胞体外成熟（In vitro maturation，IVM）是体外受精技术（IVF）、胞浆单精子注射技术（ICSI）和克隆技术等成功与否的关键。近几年，猪的卵母细胞体外成熟受到广泛关注。为了解决猪胚胎体外生产中的两个主要难题（细胞质成熟不充分以及多精受精现象），人们首先将目光放在如何提高卵母细胞体外成熟质量上[1，2]。卵母细胞体外成熟的质量对体细胞核移植成功率的影响巨大，目前进行克隆猪和基因修饰猪研究所用的卵母细胞主要有两种来源：体内成熟卵母细胞和体外成熟卵母细胞。应用体内成熟卵母细胞的优点是卵母细胞成熟质量好，核移植后重构胚发育潜能高；缺点是数量有限，获取成本高昂。而体外成熟卵母细胞来自于屠宰场收集的卵巢，因此数量大，成本相对较低，但是其成熟质量与体内成熟卵母细胞有很大差距。 　　本试验对猪卵巢的采集月份、保存温度、保存时间等因素对猪卵母细胞体外成熟的影响进行了分析与探讨，旨在为提高猪卵母细胞体外培养成熟的质量及猪胚胎体外生产提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　DPBS购自Gibco公司；孕马血清促性腺激素（PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（HCG），宁波激素制品厂；其他试剂如未特别注明，均购自Sigma公司。 　　1.2 溶液 　　卵母细胞体外培养液为改良TCM199（mTCM199），添加3.05 mmol/L葡萄糖，0.91 mmol/L丙酮酸钠，0.57 mmol/L L-半胱氨酸，1.00 mmol/L L-谷氨酰胺，10 ng/mL表皮生长因子（EGF），10 IU/mL HCG和10 IU/mL PMSG，75 μg/mL青霉素，50 μg/mL 硫酸链霉素，10%猪卵泡液（pFF）；洗卵液用DPBS；脱卵液用0.1%透明质酸酶。 　　1.3 方法 　　1.3.1 卵母细胞的采集和体外成熟培养 猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢立即置于盛有26～37 ℃生理盐水（含160万IU的青霉素和15万IU的链霉素）的保温瓶内，2 h内送回实验室，用适量生理盐水（26～37 ℃）冲洗3～5次，盛于500 mL 烧杯中，放在水浴锅（37 ℃）上。用镊子夹取卵巢，再用生理盐水润湿灭菌纱布包裹，采用10 mL注射器（16号针头）抽吸直径为3～6 mm 的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37 ℃水浴保温的锥型灭菌试管中，抽完后静置15～20 min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体（COCs），转移到DPBS 液滴中，冲洗3次，mTCM199 基础培养液洗3次，然后转入盛有mTCM199基础培养液的5孔板中。 　　1.3.2 猪卵泡液（pFF）的制备 抽取卵巢上3～6 mm 直径的卵泡，将抽取的卵泡液放入离心管中离心（3 000 r/min）18 min，取上清液，于超净工作台内以0.22 μm滤膜过滤后分装于0.5 mL离心管中，-20 ℃冷冻保存备用。 　　1.3.3 卵母细胞成熟的观察及鉴定 COCs培养44 h，在4×10倍实体显微镜下观察卵丘细胞扩散情况及胞质发育是否均匀，然后将COCs转移到0.1%透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第一极体排出作为卵母细胞成熟的主要指标。 　　1.4 数据分析 　　用t检验与方差分析对试验数据进行统计分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 卵巢采集月份对猪卵母细胞体外成熟的影响 　　本试验在不同的月份采集卵巢，并且对抽取的卵母细胞的成熟率进行观察，其结果见表1。由表1可见，5～7月和8～10月期间从屠宰场所取卵巢的COCs数量显著高于2～4月和11月至次年1月（P0.05），而且卵巢卵母细胞体外核成熟率在5～7月和8～10月期间也显著高于2～4月和11月至次年1月。 　　2.2 卵巢保存温度对猪卵母细胞体外成熟的影响 　　由表2可见，将采集的猪卵巢分别置于15、20、25、30和35 ℃的生理