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猪圆环病毒2型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR诊断方法建立 　　摘要：根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计特异性引物，PCR扩增获得猪圆环病毒2型ORF2基因片段，并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化，建立了猪圆环病毒2型的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法。扩增产物的溶解曲线分析只出现1个单特异峰，无引物二聚体，对PRV、PPV、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号，可重复性好，测灵敏度可达4.0×101拷贝/μL。结果表明，建立的猪圆环病毒2型SYBR Green I 实时荧光定量PCR具有特异、灵敏、快速、重复性好，适合于猪圆环病毒2型临床样品的检测。 　　关键词：猪圆环病毒2型；ORF2基因；SYBR Green I荧光定量PCR 　　中图分类号：S854.4+3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5474-04 　　猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2， PCV-2）主要导致断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的发生，表现??免疫系统损伤，淋巴细胞减少、淋巴结肿大等病变，同时引起其他病原的继发感染，目前已成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一[1-3]。目前检测PCV-2主要有ELISA、胶体金、PCR等方法，但ELISA、胶体金主要用于检测PCV-2抗体，且操作复杂、耗时长[4，5]。普通PCR不能进行定量分析，且灵敏度相对较低，无法检测猪场的隐性感染。荧光定量PCR是与常规PCR比较，具有重复性好、灵敏度高、能够定量等优点，已经被广泛应用于多种疾病病原的检测[6，7]。本研究根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计特异性的引物，利用PCR技术扩增获得猪圆环病毒2型ORF2基因片段，并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化，建立猪圆环病毒2型的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，为猪圆环病毒2型临床样品的检测提供科学的诊断方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　菌株：PCV-2、PRV闽-1株、PPV强毒株7909、CSFV、PRRSV、猪源大肠杆菌由贵州省畜禽疫病研究实验室保存。 　　主要试剂及仪器：Goldview、Tris、EDTA、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相应10×Taq Buffer、dNTP、DH5α，pMD-18T、SYBR Green I荧光定量PCR酶等购自宝生物（大连）工程有限公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。荧光定量PCR仪为Eppendorf Mastercycler ep realplex 4实时荧光定量PCR仪。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 引物设计 根据ORF2 GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计1对特异性引物，上游引物：5′-GGAAGACCAATGTACACGTCATT-3′，下游引物：5′-GGTGGTTTCCAGTATGTGGTTTC-3′，引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。 　　1.2.2 病毒核酸的提取 　　1）组织样品：取待检样品淋巴结组织样品共约0.5 g，加入500 μL PBS缓冲液，待检样品研磨后-70 ℃反复冻融3次，12 000 r/min离心取上清液用于核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA/RNA于-70 ℃保存。猪大肠杆菌参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA-20 ℃保存。 　　2）血清样品：取50 μL血清加入等体积的血清裂解缓冲液（50 μmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 μmol/L NaCl，2 μmol/L EDTA，1%Triton×100，5%SDS），混匀后煮沸5 min，12 000 r/min离心取上清液2 μL用于荧光定量PCR和普通PCR。 　　1.2.3 pMD-18T-PCV2-ORF2阳性标准品的制备 　　用“1.2.1”中的引物，对PCV-2进行PCR扩增，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环； 72 ℃ 10 min。将扩增的目的片段与pMD-18-克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，重组体命名为pMD-18T-PCV2-ORF2，同时送宝生物工程（大连）有限公司测序。用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒p