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犬细小病毒病DNA疫苗研究进展 　　摘要：犬细小病毒病是犬的一种具有高度接触性的烈性传染病。近年来，在犬细小病毒新型疫苗研究方面取得了新的进展，特别是DNA疫苗，笔者就犬细小病毒DNA疫苗的作用机理、抗原基因、载体选择、分子佐剂的研究进展方面进行系列论述。 　　关键词：犬；细小病毒；DNA疫苗 　　中图分类号： S858.292.265+.5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0231-03 　　犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一种急性传染病，该病毒属细小病毒科，细小病毒属[1]。病毒经消化道感染健康犬后，主要攻击2种细胞，一是肠上皮细胞，二是心肌细胞，分别表现出血性肠炎型和非化脓性心肌炎型，心肌炎以幼犬多见[2-3]。CPV自1978年被首次分离以来[4]，已在世界范围内迅速传播。目前，该病主要通过弱毒苗预防，但免疫效果不理想[5-6]，因此，新型基因工程疫苗逐渐成为研究的热点，特别是DNA疫苗倍受国内外学者关注。 　　1 作用机理 　　DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是20世纪90年代Wolff等首创的新型疫苗[7]，把主要抗原基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注入动物体内，使外源基因通过宿主细胞合成抗原蛋白，进而诱导宿主产生特异性免疫应答[8-9]。 　　DNA疫苗接种机体后，质粒被周围的组织细胞（如肌细胞）抗原递呈细胞（APC）或其他炎性细胞摄取，被吸收的质粒在机体启动子作用下合成mRNA，并被细胞质中的酶复合物-蛋白酶体所降解，形成氨基酸肽段，然后经抗原转运蛋白（TAP）转运至内质网腔进一步修饰成氨基酸短肽[10]。这些短肽片段在内质网腔与新合成的MHC-Ⅰ分子的抗原结合槽相结合，形成抗原肽-MHC-分子复合物，并转运至细胞表面作为免疫原信号肽供 CD8+细胞毒性T细胞（CTL）所识别，导致其活化、增值并分化为具有杀伤能力的效应 CTL，诱导产生较强的细胞免疫反应[11]。 　　另一部分蛋白抗原从分泌它们的APC的细胞膜上进入MHC-Ⅱ类型途径，DNA疫苗基因表达的抗原蛋白未经加工被释放出去由专职的APC摄取后，在细胞内经过吞噬体和溶酶体作用后被降解成具有抗原特异性的多肽，这些多肽同细胞内质网产生的 MHC-Ⅱ分子相结合并转运到细胞膜上，被CD4+辅助性T细胞（Th）的受体识别。Th细胞分泌淋巴因子，刺激B 细胞转化为浆细胞，产生抗体，诱导了抗原特异型的体液免疫应答[12]。 　　DNA疫苗具有许多优点：可同时诱导体液免疫和细胞免疫、可将含有不同抗原基因的质粒混合起来联合免疫、可在同一载体上插入多种基因、可持续表达外源蛋白、易于构建和制备、稳定性好。近年来，在犬细小病毒病新型疫苗的研发中也显示出其独特的优势。 　　2 抗原基因 　　CPV基因组主要编码VP1和VP2 2种结构蛋白。VP2基因全长1 755 nt，编码的584 氨基酸残基组成的蛋白是构成衣壳的主要蛋白，约有60 个拷贝，VP2上的几个关键碱基和氨基酸的变化就会改变抗原特性和宿主范围[13]，表位图谱试验表明，结合中和抗体的全部抗原决定基因都在VP2中[14]。VP1基因全长2 256 bp，包含VP2基因的完整阅读框架，2者的3′端完全重叠。VP1、VP2的序列基本相同，只是VP1的氨基端比VP2多一段氨基序列，这段序列中含有T细胞识别表位，能够激发机体产生细胞免疫，而细胞介导的免疫应答反应是基因免疫诱导机体抵抗病原攻击的一个重要机制。因此VP1、VP2都可以作为DNA疫苗的主要抗原基因。 　　Parrish等用含CPV VP1基因的真核表达质粒免疫犬，攻毒保护试验证明基因疫苗能够保护犬不被CPV感染[15]。Jiang W等构建了表达CPV VP1蛋白的真核表达载体pGT36VP1[16]，将5只9月龄的犬分别接种不同剂量的pGT36VP1，结果显示免疫1周后，血清中可检测到抗体IgG，2周左右达到峰值，约14周后抗体消失，所有免疫pGT36VP1疫苗的犬均能抵抗 CPV强毒的攻击，而生理盐水的对照组全部发病，证实了接种CPV VP1核酸疫苗能够诱导机体产生抗CPV的特异性免疫反应。邱薇等构建真核表达载体pIRES VP1重组质粒也能抵抗 CPV强毒的攻击[17]。 　　Gupta等含CPV VP2 DNA质粒表达载体免疫家犬获得了较好的免疫反应[18]。韩冬梅等利用DNAstar软件对CPV VP2基因以及编码的氨基酸序列进行分析，确定了VP2蛋白抗原表位基因（VP2蛋白第490～559位氨基酸）[19]，即 VP2-70 构建了融合的真核表达载体pcDNACD5sp-LTB-VP2-70，也能够诱导机体产生抗体IgG2a