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生长抑制因子5逆转Warburg效应抑制肿瘤增殖研究 　　[摘要] 目的 研究生长抑制因子5（ING5）对肺癌A549 细胞Warburg效应的影响。 方法 肺癌A549 ING5过表达细胞系通过慢病毒转染GV218-EGFP-ING5（吉凯基因）构建，空质粒转染为对照细胞系A549-control。Western blot验证ING5的表达；增殖和克隆形成实验观察ING5对A549细胞增殖和克隆形成的影响；乳酸脱氢酶（LDH）活性和乳酸（LD）分泌检测实验观察ING5对A549细胞Warburg效应的影响。 结果 Western blot结果表明，A549-ING5-OE的ING5表达显著高于对照组，差异有高度统计学意义（P 0.01）。增殖和克隆形成实验结果表明，A549-ING5-OE的增殖和克隆形成能力较对照组显著降低，差异有统计学意义（P 0.05或P 0.01）。LDH活性和LD分泌检测实验结果表明，A549-ING5-OE的LDH活性和LD分泌较对照组明显降低，差异有高度统计学意义（P 0.01）。 结论 ING5通过逆转肺癌A549细胞的Warburg效应抑制其增殖。 　　[关键词] 肺癌细胞；生长抑制因子5；Warburg效应；增殖；克隆形成 　　[中图分类号] R730.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（c）-0004-04 　　代谢重组是诱导肿瘤发生发展的重要机制之一[1-2]。肿瘤组织在有氧条件下主要依赖糖酵解获能的代谢方式称为“Warburg效应”[3]。Otto Warburg首次发现并认为这种代谢方式的转变是促进癌变的主要诱因[4]。生长抑制因子（inhibitor of growth，INGs）是近年来发现的重要抑癌基因家族[5-7]，该家族包含ING1～5五个成员。INGs家族蛋白高度保守，由C端结构域、中央区和N端结构域三部分组成[8-9]。ING5是该家族新成员，研究发现ING5与P53相互作用能够抑制细胞生长和诱导细胞凋亡[10]。此外，有研究报道ING5能够抑制肿瘤增殖和上皮间质转化（EMT）[11]，同时诱导细胞周期阻滞，促进细胞分化、自噬和凋亡[12]。 　　目前关于ING5的研究报道较少，其抑癌作用及机制尚无突破性进展。本文拟研究肺癌A549细胞ING5过表达对Warburg效应及增殖的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　A549细胞（上海中科院细胞库），GV218载体（上海吉凯基因化学技术有限公司），G418（美国Gibco公司），高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液（美国HyClone公司），青链霉素混合液（北京Solarbio公司），BCA试剂盒、SDS凝胶试剂盒、裂解液（西安碧云天科技生物有限公司），蛋白酶抑制剂（瑞士Roche公司），ING5抗体（美国Proteintech），ECL化学发光试剂盒（美国Advansta公司），兔二抗（英国Abcam公司），4%多聚甲醛溶液（西安科昊生物技术有限公司）。 　　1.2 肺癌A549-ING5-OE细胞株的构建 　　含ING5 cDNA的慢病毒载体和对照载体为吉凯公司构建。0.25%的胰酶消化293T细胞后计数并调整密度为6×105个/mL接种于培养皿，37℃，5% CO2孵箱培养至密度约80%?M行转染。转染前2 h换无血清DMEM，加入转染复合物继续培养8 h后弃掉上清液，PBS清洗后加入10% FBS的DMEM继续培养48 h，收集上清液1000 r/min离心3 min，所得上清液为病毒颗粒浓缩液。取对数生长期肺癌A549细胞，用上述病毒颗粒浓缩液进行感染12 h后观察细胞状态，无明显细胞毒副作用则继续培养24 h后换新培养液，感染3 d后观察EGFP基因的表达。感染后的A549细胞计数并调整密度为300个/孔接种于6孔板内继续培养。用5 μg/mL的G418筛选，每隔24 h更换新培养液，筛选3 d后用荧光显微镜观察细胞克隆，挑取阳性克隆扩大培养至所需细胞量。 　　1.3 Western blot检测ING5的表达 　　取对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞，0.25%的胰酶消化，4℃预冷的PBS洗涤、离心后加入适量裂解液混匀冰上裂解30 min。细胞裂解液组成：0.1%SDS、150 mmol/L NaCl、0.5%脱氧胆酸、1%NP-40和50 mmol/L Tris（pH 8.0），裂解前加入蛋白酶抑制剂（1∶25），低温离心机离心30 min后所得上清为细胞总蛋白，BCA试剂盒定量。采用SDS凝胶试剂盒配制10%分离胶和6%浓缩胶，上样后开始电泳（浓缩胶100 V，30 min，分离胶1