红肉苹果MpMYB30基因克隆及表达载体构建.docVIP

红肉苹果MpMYB30基因克隆及表达载体构建 　　摘　要：MYB转录因子是植物转录因子中最大的家族之一，在转录调节中起着多方面的重要作用。实验利用RACE技术从野生红肉苹果(Malus　pumila var.niedzwetzkyana Schneid.)中获得了M9MYB30的全长序列，利用生物信息学的方法对其蛋白进行了分析和预测并将其连接到pCAMBIA―S1300+植物表达载体中。结果表明，该基因全长为1 661bp，推导的氨基酸序列经系统发育分析与葡萄MYB30及蓖麻MYB基因相似性最高，命名为MYB30，其N端含有2个约55个氨基酸组成的MYB特征结构域。该基因推导的YB30蛋白的分子式为C1790H2794N538O584S12，相对分子质量为41579.8ku，等电点为6.30，不存在信号肽和跨膜区域，蛋白质结构以d螺旋为主。利用Xbal I 和Sac I对重组质粒进行酶切，并将其连接到pCAMBIA-S1300+载体上，通过抗性筛选和PCR酶切检测，证实了MpMYB30基因已经构建到植物表达载体pCAMBIA―S1300+上。 　　关键词：红肉苹果；MpMYB30；生物信息学；表达载体构建 　　中图分类号:S661.1　文献标识码：A　文章编号： 1009-9980(2010)04-483-07 　　 　　MYB转录因子最早从鸟类的白血病病毒AMV和E26中发现，是植物中最大的转录因子家族之一，其共同特征为含有MYB结构域。植物中的MYB类转录因子在二次代谢、细胞的形态建成、环境应答、细胞周期调控、脂肪酸生物合成以及激活过敏细胞程序性死亡应答中起到一定的调控作用。Daniel等从拟南芥中分离到一个参与抗病反应的AtMYB30基因，研究结果表明其在细菌引起的HR反应中激活调控细胞死亡的起始。2008年，Raffaele等，更进一步提出作为植物细胞死亡的信使，At-MYB30参与调节HR反应及其自身的脂肪酸长链和其延伸物。 　　红肉苹果，古书称其奈。红肉苹果为落叶乔木，为我国苹果树中的稀有品种，具有抗逆性强、丰产等特点，是育种的珍贵材料。因此，以红肉苹果为试材，旨在寻找和分离更多MYB基因，为苹果育种工作开创崭新途径。 　　我们利用RACE技术，克隆了野生红肉苹果MpMYB30基因，利用生物信息学的方法对其推导的氨基酸进行了分析和预测，并将其连接到植物表达载体中，从分子水平上揭示MYB蛋白的进化关系、理化性质、跨膜区域及其空间结构，从而为下一步研究该基因的功能及其作用机理奠定基础。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　1.1.1　植物材料　野生红肉苹果由辽宁省兴城果树研究所苹果国家种质资源圃提供。 　　1.1.2菌株和栽体大肠杆菌DH5a菌株由本实验室保存，pMDl8simple-T载体购自TaKaRa公司。 　　1.1.3　主要生化试剂　反转录酶购自ToYoBo公司，限制性内切酶、rTaq酶、Hs-Taq酶、RNase H酶、dNTP、DNA Marke购自TaKaRa公司，DNA胶回收试剂盒为爱思进公司生产。引物由上海英俊生物有限公司(invitrogen)合成，表达载体pCAMBIA-S1300+为本实验室保存。 　　 　　1.2方法 　　1.2.1　RNA提取与合成　叶片总RNA的提取采用CTAB法㈣。按照ToYoBo公司反转录酶使用方法进行，20μL反应PCR体系含有：XμL(1μg)总RNA，4μL 5xRTbuffer，2μL dNTP混合物(10mmol?L-1)，1 μL RNase抑制剂(10U?μL-1)，1μLRll466(表1)和1μL酶，其余用RNase-Free ddH2O补齐。PCR反应程序：37℃10min，42℃40min，99℃min，4℃10min。合成后的cDNA于-20℃保存备用。 　　 　　1.2.2　MpMYB30基因保守片段扩增　以cDNA为模板，用引物F1和R1(表1)进行PCR扩增，反应体系为25μL：cDNA 1μL，引物各1μL，rTaq酶0.125μL，dNTP 2μL，MgCl21μL，ddH2O 16.875μL；反应参数为94℃预变性4min，94℃45s、56℃40s、72℃2min、40个循环，72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目标片段，进行克隆，测序由上海英俊生物有限公司(invitrogen)完成(下同)。以该序列为靶序列，在苹果的EST数据库中进行搜索，并利用DNAMAN5，22软件对同源性大于70％的序列进行拼接，获得了该转录因子cDNA的5’端和部分开放阅读框(0RF)序列。 　　1.2.3　MpMYB30基因的3’RACE以cDNA为模板，用引物MYB30-3’