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脑损伤后神经细胞凋亡变化及黄体酮保护作用研究 　　[摘要] 目的 观察脑损伤后神经细胞凋亡变化及黄体酮的保护作用。 方法 雄性SD大鼠随机分为假手术组、脑损伤组和黄体酮治疗组，大鼠脑损伤模型制作是利用改良的Feeney自由落体损伤装置。各组于伤后24、48、72 h取材。用免疫组织化学法观察大鼠皮质和海马CA1区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表达水平变化。 结果 脑损伤组的Caspase-3阳性细胞数在皮质和海马CA1区较假手术组显著增加，黄体酮治疗组与脑损伤组比较，Caspase-3阳性细胞数明显减少，差异有统计学意义（P0.05）。 结论 黄体酮抑制脑损伤后Caspase-3的表达可能是黄体酮脑保护作用机制之一。 　　[关键词] 黄体酮；脑损伤；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 　　[中图分类号] 651.1+5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（a）-0012-03 　　脑损伤是严重危害人类健康和威胁生命的疾病之一。脑损伤后的继发性损伤以往认为主要是神经细胞水肿和坏死，近年发现创伤性脑损伤后存在10%～50%的细胞凋亡，而且主要存在于皮质和海马等部位。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）处于细胞凋亡过程中的关键地位，是细胞凋亡过程的最终执行者[1]，在脑损伤后各种病理因素作用下，Caspase-3被激活，通过作用于底物引起细胞凋亡。对脑损伤后的继发性损伤，目前尚无有效的治疗药物。近年研究发现，黄体酮（progesterone，PROG）作为一种神经甾体激素，在体内、体外等多种实验中已经证实具有脑损伤保护作用[2]，但PROG对脑损伤后细胞凋亡的影响存在争议。本实验通过建立Feeney自由落体大鼠脑损伤模型，利用免疫组织化学技术，探讨PROG对大鼠脑损伤后Caspase-3表达的影响，以阐明PROG对脑损伤的保护作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料及仪器 　　恒冷箱组织切片机，CM1900型，德国Leica公司；Olympus显微摄影装置，PM-10AD型，日本Olympus公司。PROG试剂，购自Sigma公司；Caspase-3一抗试剂，购自武汉博士德公司。 　　1.2 实验分组 　　雄性成年SD大鼠54只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重250～300 g。实验动物随机分为3组：假手术组18只、脑损伤组18只、PROG治疗组18只；每组又分为24、48、72 h 3个时间点检测细胞凋亡的变化。 　　1.3 动物模型 　　采用改进的Feeney自由落体方法建立大鼠创伤性脑损伤模型。麻醉采用10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉后切开头皮，打开直径5 mm的骨窗，其位置在矢状缝后1.5 mm，中线旁2.5 mm处；自由落体重锤质量40 g，从25 cm 处高度自由落下造成脑损伤。假手术组仅切开头皮，在相同位置开同样大小的骨窗。PROG试剂溶解于22.5% 2-羟丙基-β-环糊精溶质中，PROG治疗组伤后1、6 h腹腔注射PROG 16 mg/kg以利于快速吸收，接下来连续每天1次皮下注射。 　　1.4 免疫组织化学检测 　　分别于伤后24、48、72 h 3个时间点，对大鼠脑组织进行甲醛灌注，并且取材固定，自视交叉后做片厚5 μm的冠状切片待用。Caspase-3免疫组织化学检测采用SP法，按照免疫组织化学法说明书加入一抗和二抗等操作。切片在400倍光镜下观察，利用免疫组织化学CMIAS真彩色医学图像自动分析系统进行阳性细胞计数，以5个视野的平均值代表各区计数结果。 　　1.5 统计学处理 　　数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，以P 0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　假手术组少见Caspase-3表达，脑损伤组伤灶周围皮质和海马CA1区，可见大量Caspase-3阳性细胞表达；与假手术组比较，脑损伤组的Caspase-3阳性细胞表达明显增高，差异有统计学意义（P0.05）；黄体酮治疗组在损伤的周围皮质和伤侧海马CA1区Caspase-3表达与脑损伤组比较明显减少，差异有统计学意义（P0.05）（表1）。 　　3 讨论 　　随着社会的发展，脑损伤患者逐年增多。发达国家的颅脑损伤年发生率高达（150～250）/10万人；我国颅脑损伤的年发生率为（100～200）/10万人，直接和间接经济损失高达数百亿元。脑损伤可以分为原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤无法恢复；而继发性损伤通过钙超载、兴奋性神经递质的释放、脂质过氧化反应、自由基产生、炎症反应等多种因素加重脑损伤，进而影响神经功能[3-4]。其中细胞凋亡在继发性脑损伤中扮演重要角色[5-6