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耐盐基因Hal1克隆及表达载体构建 　　摘要 以酵母菌株BWG1-7A基因组DNA为模板，利用PCR方法，扩增出耐盐基因Hal1，测序表明该基因全长为885个核苷酸，与已发表的序列NC_001148比较，同源性99.3%。将该基因插入表达载体pYES2的BamHI和EcoRI酶切位点之间，构建表达载体pYES2-Hal1，序列测定完全正确，为植物表达载体的构建打下基础。 　　关键词 耐盐性；Hal1基因；克隆 　　中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2009）07-0243-02 　　 　　Cloning of Hal1 gene and construction of its expression plasmid 　　SHEN Yan1，2 CHEN Xia1 CHEN Yan GONG Yi 1 * CHEN Yu-guang 2 　　（1 Research Center of Biotechnology Shanghai Institutes for Biological Sciences the chinese Academy of Sciences，Shanghai 200233； 　　2 School of life Sciences，Shanghai University） 　　Abstract Taking Saccharomyces cerevisiae BWG1-7A genomic DNA as template，Hal1 gene is amplified by PCR. The amplified product was digested with BamHI and EcoRI enzymes，then ligated into pYES2 vector. The recombinant pYES-Hal1 was successfully constructed and verified by DNA sequence，which provided a foundation of the construction of plant expression vector. 　　Key words Salt tolerance；Hal1 gene；Cloning 　　 　　随着全球水资源危机以及土壤盐化问题的加剧，盐胁迫已经成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要限制因素[1]。目前，全世界大约有20%的农业用地的盐碱化程度在不断加重，预计到2050年，将会有超过50%的耕地会变得盐碱化[2]。在当前世界人口急剧增长、食品供给增长相对缓慢的情形下，只有采取一定的措施应对日趋严重的环境压力，才能确保人类的食品安全，维持农业生产的可持续发展。为了达到这一目标，就必须了解盐胁迫对植物生长发育的影响，弄清植物耐盐的机制，并通过农业和生物技术手段改良农作物，以增强它们的耐盐性，使其最终为人类的生产和生活服务。耐盐基因Hal1最初来源于啤酒酵母的第16号染色体，具有提高细胞中K+含量，降低Na+含量，也就是提高K+/Na+的比率[3，4]，从而可以提高细胞耐盐性的作用。本研究成功克隆了耐盐基因Hal1，并将它连接到pYES2表达载体上，测序表明其与已发表的序列比较，同源性99.3%，构建重组质粒pYES2-Hal1，序列测定完全正确，为下一步利用该基因提高生物的耐盐水平提供了技术支持。 　　 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 试验材料 　　酿酒酵母BWG1-7A，大肠杆菌菌株DH5α，JM109，质粒pYES2均为中科院上海生命科学研究院实验室保存；KOD酶购自TOYOBO公司，T4连接酶、BamHI和EcoRI酶购自TaKaRa公司；质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司；引物由上海英骏生物技术公司合成；其他化学试剂购自上海生工公司。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 酵母基因组ＤＮＡ的提取。将活化的菌种接种于YPD培养基过夜培养，收集菌体后用Lyticase 酶解酵母细胞壁获得原生质体，参照亚当斯A等[5]采用SDS裂解酵母细胞，提取酵母基因组总DNA。 　　1.2.2 Hal1基因的扩增。根据GenBank数据库中Hal1基因序列信息（序列登记号：NC_001148），用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，上游引物（P1）为5′－CGCGGATCCAT GCATTTCAAAGATTTAGGATTGCATACTACACTC－3′， 下游引物（P2）为5′-CCGGGAATTCTCAACTATTCTGT GTTG－3′，下划线分别代表BamHI和EcoRI酶切位点。在20μL