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荷多糖提取工艺及其体外抑菌活性研究 　　摘要：在单因素实验的基础上，进行3因素3水平的Box-Behnken中心组合实验设计，利用响应面分析优化■荷多糖的最佳提取工艺；对此工艺下的提取液进行浓缩，通过牛津杯法和二倍稀释法探讨其抑菌活性。结果表明：在优化工艺条件处理温度91.67℃、液料比25.0mL/g、处理时间1.5h时，■荷多糖得率为10.15%，与预测值9.94%的相对误差仅2.07%；■荷多糖对大肠杆菌、黑曲霉和酿酒酵母没有体外抑制作用，但对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有体外抑制作用，其MIC分别为0.4930mg/mL、1.9722mg/mL，MBC分别为1.9722mg/mL、7.8886mg/mL。■荷多糖可作为一种新型抗菌药物开发，其提取工艺可用响应面法进行回归分析和参数优化。 　　关键词：多糖；■荷；响应面；提取工艺；体外抑菌 　　项目基金：安徽省高校自然科学研究重点项目（KJ2018A0413）；安徽省林业科技攻关团队（2017062）；安徽省林业科技攻关计划项目（2018061）；安徽省2018年度重点研究与开发计划项目（编号：1804 　　中图分类号： R931.71 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.14.029 　　■荷（Zingiber mioga （Thunb.） Rosc. ），又名?荷、茗荷、观音花、莲花姜、野姜等，属药食两用的姜科多年生草本植物，广泛分布我国南方地区。而植物多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫、调节造血功能等多种功效。但目前有关■荷多糖的研究仍比较少见，仅谭志伟等研究了传统的热浸提工艺和提取物的抗氧化性[1，2]，陈仕学等研究了微波辅助提取工艺[3]，邱岚等研究了超声辅助提取工艺[4]，朱培蕾等研究了■荷水溶性多糖的理化性质及其体外抗氧化活性[5]。本文在响应面法优化■荷多糖提取工艺的基础上，对其抗菌活性进行研究，以期为■荷资源的有效开发和新型抗菌药物的获得提供前期基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与材料 　　HH恒温水浴锅（金坛市金城国胜实验仪器厂），SHZ-D循环水真空泵（郑州予华仪器有限公司），H2050R台式高速大容量冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），ZD-85气浴恒温振荡器（金坛市杰瑞尔有限公司），DHP-9272数显电热培养箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司），YX-450电热蒸汽压力消毒器（上海三申医疗器械有限公司），SW-CJ-1C洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）等。硫酸、苯酚等均为分析纯（西陇化工股份有限公司）。■荷从大别山区采集。实验菌株包括以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）为代表的革兰阳性细菌，以大肠杆菌（Escherichia coli）为代表的革兰阴性细菌，以黑曲霉（Aspergillus niger）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为代表的真菌。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 ■荷多糖的测定 根据苯酚-硫酸法，设置葡萄糖标准液的浓度梯度，建立其吸光度与葡萄糖质量M（μg）的线性关系，从而计算■荷多糖质量[6]。 　　1.2.2 确定单因素范围 　　（1） 处理温度（X1）：分别称取3.0g过80目筛的■荷粉末，计5组3个重复共15份；每份用45mL蒸馏水溶于三角瓶后，各组分别置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃的水浴中浸提2h；提取液4000转速离心10min，Sevag法脱蛋白后滤液50mL容量瓶定容；取100uL提取液稀释100倍，稀释提取液，取其1mL按苯酚-硫酸法测定多糖浓度，以确定处理温度。 　　（2）液料比（X2）：同上，按10mL/g的液料比梯度，确定15～45mL/g范围内的液料比。 　　（3）处理时间（X3）：同上，按0.5h的时间梯度，确定1～3h范围内的处理时间。 　　1.2.3 响应面优化 响应面采用Design-Expert.8.0.6软件设计，处理温度（X1）、液料比（X2）和处理时间（X3）为自变量，■荷多糖提取得率（Y）为响应值。 　　1.2.4 体外抑菌 纯化供试菌种制成菌悬液备用。■荷多糖浓缩物体外抑菌效果以牛津杯法测定；■荷多糖最低抑菌浓度（MIC）以二倍稀释法测定，对有抑菌效果的二倍稀释液移种到培养基上，根据培养皿中菌落生长情况测定■荷多糖最小杀菌浓度（MBC）[7]。 　　2 结果与分析 　　2.1 ■荷多糖的测定 　　经测定，吸光度A与多糖质量M的线性关系为A=0.007M+0.0038，R=0.9998，相关系数符合国家标准高于0.99的要