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脱氧核糖核酸分子设计在电化学生物传感器中应用 　　摘要 基于特殊DNA序列的构型变化的电化学生物传感器是一种高灵敏、高特异性的生物分析方法。固定在电极表面的特殊DNA探针（茎环、核酸适配体、四聚体等）因为目标物质的结合而发生构型变化，从而产生可检测的电化学信号，这种策略操作简便而且特异性强，引起了研究者的广泛关注。本文总结了目前基于基因构型变化的电化学生物传感器的发展历程。 　　关键词 电化学传感器；基因传感器；核酸适配体；分子信标；评述 　　2010-10-18收稿；2011-03-20接受 　　本文系国家自然科学基金（No、国家质检总局科技计划项目（No.HOORJ906）和上海市科委科研计划项目（No.10142201700）资助 　　E-mail: fchh@；rensz@ 　　1 引言 　　为了满足对脱氧核糖核酸（DNA）序列或者蛋白的快速、便捷、高灵敏度和高选择性检测的需要，人们研究了各种的DNA传感器：包括光学传感器［1,2］、电化学传感器、质量传感器［3,4］和声学传感器［5］等，其中电化学基因传感器因为灵敏、快速、低成本和低能耗等显著的特点受到广泛关注。 　　采用电化学方法检测DNA杂交可以通过引入一个具有电化学活性的插入剂作为信号基团，该基团特异性插入DNA双链的分子，通过检测这种插入基团的电化学氧化还原信号，可以感知DNA杂交反应的发生［6～8］。Barton和合作者通过电化学催化将插入剂的氧化还原反应放大，大大提高了这种DNA传感器的灵敏度，从而实现了对单碱基错配的检测。但是插入剂基团难免会发生非特意的吸附，从而导致较大的本底信号［9］。为了降低DNA传感器的本底信号，三明治夹心法DNA传感器被研发出来并最终得以商业化［10，11］。夹心法DNA传感器需要引入两条分别与目标DNA两端杂交的探针，一条用于组装在电极表面，另一条用于电化提供学活性基团，或者能够催化电化学反应的酶，当有目标DNA存在时，通过3条DNA通过杂交形成三明治夹心结构，信号探针上的电化学活性基团或者酶提供可以被检测的电化学信号。 　　尽管以往的DNA传感器在灵敏度和特异性方面得到了较大的提高，实现了对10－12～10－15mol/L的目标DNA的高灵敏检测［12～18］，但是为了达到这样的灵敏度，传统的DNA传感器需要采用多种插入剂［19］和复杂的催化放大步骤，或者需要引入一个信号探针序列。而基于DNA构型变化设计的生物传感器是一类操作简单、无标记的生物传感器［20, 21］，该策略首先在电极表面固定一条特殊的DNA探针，目标物质的存在和结合将导致电极表面DNA探针构型发生变化，进而诱发一个可检测的电流信号变化。这种传感器操作简便，与传统生物传感器相比，是一种快速、无标记，并且操作方便、易实现重复使用的生物传感平台。 　　2 电化学生物传感器的基本类型 　　基于DNA构型变化设计的电化学生物传感器的核心部分是一条固定于电极表面的特殊DNA探针，当DNA探针与目标分子结合之后，会发生明显的构型改变，根据不同的检测原理，可以将这类传感器分成两种：一种是基于探针构型发生变化之后，导致探针一端的电化学修饰与电极的距离发生改变，或者说与电极接触的几率发生改变，从而影响电流信号大小；另外一种是基于扩散控制的电化学过程对表面探针的组装状态的敏感性，当电极表面的DNA探针的构型发生改变，组装层的厚度和密度发生改变，从而影响电化学扩散过程，使电流信号发生明显改变。 　　第一种传感器是在溶液相分子信标（Molecular beacon）基础上发展起来的。分子信标检测的核心内容是DNA杂交前后探针两端距离发生的明显改变。分子信标（图1）是一种可以特异性识别核酸序列的荧光探针, 它的中间一段可以与目标DNA特异性结合，称为环（Loop）区；它的两边可以相互杂交，称为茎（Stem）区。分子信标两端分别修饰一个荧光基团和一个淬灭基团。这种荧光探针通过与核酸靶分子进行杂交后发生构象的变化而发出荧光［22, 23］。分子信标具有背景信号低、灵敏度高、特异识别性强、操作简单、不必与未反应的探针分离即可实时检测，可用于活体分析等优点，因此提出之后很快在生物化学分析、生物医学研究和临床诊断中获得广泛的应用。 　　受到溶液相分子信标的启发，2004年，Fan等［24］成功设计了基于DNA构型变化的固相电化学DNA传感器（Electrochemical DNA，E-DNA）（图2）。这种E-DNA体系由一条两端自配对形成茎环结构的DNA探针构成，探针一端修饰有巯基，用于组装于金电极表面，另一端修饰有具有电化学活性的标记作为信号基团，二茂铁基团（Ferrocene）和亚甲基蓝（Methylene blue）是常用的信号基团。无目标