扁桃泛素降解途径关键酶基因的克隆与表达分析-遗传学专业论文.docxVIP

摘要 自交不亲和这一遗传机制对于高等植物实现异花受精和遗传重组具有重要 意义。大多数扁桃都是离度自交不亲和的，因为异花授粉究生率低，使得扁桃产量 低，研究其自交不亲和的分子机制，有助于扁桃的遗传育种工作。近年来，自交 不亲和性的花粉决定因子逐渐被确定为 种 F-box 蛋白-SLFCS 一locus F-box )， F-box 蛋白是泛素连接酶 CSCF 复合物)家族的成员，这提示 z 泛素-26S 蛋白酶 体蛋白质降解系统在自交不亲和反应中可能发挥着重要作用。 本实验以扁桃品种 Pionmr 为材料。首先，利用网上资源及本实验室先前 获得的若干泛素降解途径关键酶的 EST 序列，并运用 RACE 和 RT-PCR 技术， 对下列基因进行了克隆和 tl序工作，包括泛索激活酶(El)、泛素结合酶 CE2) 和泛素连接酶 CE3) 的两个组分(cullin 和 Skpl) ，SLF 以及 S-RNase 编码基因。 目前，获得了泛素激活酶凹的部分 CDS 序列和其余基因的 CDS 全长序列，为 进一步研究官们的功能奠定了基础. 其吹，利用 RT-PCR 技术，研究了上述各基因在扁桃花药、雌器、花瓣、尊 片及叶片中的表达情况。结果显示: SLF 基因在花药中专一性表达 ，S-RNase 基 因在雌恋中专一性表达，这为它们作为自交不亲和相关的基因提供了佐证。其余 目的基因在各组织中均有表达，这可能是因为泛素降解途径作为生物体内蛋白质 降解的主要途径，会参与植物多种组织中的代谢反应。 最后，为了验证 SLF 蛋白与它可能的底物-一-S-RNase 之间是否存在相互作 用，进行了酵母双杂交实验。首先，扩增了两个基因的编码区全长，分别命名为 PdSL Fl 和 PdSm ，然后，将 PdSLFl 基因作为诱饵，克隆到酵母表达载体 pSos 上 ，PdSm 基因作为靶蛋白克隆到 pMyr 上。酶切及测序结果表明，目的基因正 确地插入了表达载体，并分别与 Sos 诱饵蛋白及 Myr 序列标签同框翻译。将 pSos PdSLF + pMyr PdSm 共转化酵母细胞后，酵母不能在选择温度。 TC) 下生长， 说明二者之间不存在物理上的相互作用，与前人的实验结果一致。 关键词g 自交不亲和性花粉 S-基因泛素降解途径酵母双杂交扁桃 Abstract In flowering plan毡， a widely used mechanísm to prevent ínbreedíng and promote outcro回ng ís known as selιíncompatibíl 均 (SI). Most almonds dísplay híβly SI. The poor efficíency of outcrossíng makes the amount of progeny very low. So the investígatíon of the molecular mechanisms of SI will benefit 也e genetic breeding of a1mond. It has recently been determined that SLF (S-locus F-box) genes contral SI on the pollen side. SLF encodes an F-box protein that ís a component of ubiquitin ligase (SCF ∞mplex) ，raising 也e possibility that the ubquiti nJ26S proteolytic system plays a centra1 role in the discrimination of selflnonself pollen in the RNase-based GSI. We use one cultivar of almond ‘ Pioneer as plant materia1s. Firstly ，there 缸e several ESTs of key enzymes in ubquití nJ26S proteolytíc system in our lab achieved previously. Using these ESTs and resources from NCBI ，we have finíshed cloníng seven genes by RACE and RT-PCR technology，íncludíng ubíquitín activating enzyme (E1)，ubiquitin conjugating