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评价肺炎链球菌疫苗免疫效果功能性抗体检测方法建立 　　[摘要] 目的 建立肺炎球菌疫苗免疫效果评价的功能性抗体滴度检测方法。 方法 参考美国阿拉巴马大学的多重调理吞噬实验（MOPA）方法，构建并鉴定HL-60效应细胞库、肺炎球菌工作菌种库和补体；在此基础上对5份血清样本进行调理吞噬活性检测。 结果 HL-60细胞分化后表面标志表达量CD35为71.78%，CD71为10.97%，活细胞比例为72.96%。13个血清型的肺炎链球菌工作菌种的冻存复活率均高于90%；抗生素抗性与敏感性与预期结果一致；工作稀释度均≥1000。补体的非特异性杀菌率均≤70%。血清样本的杀菌曲线均为标准的S型，平行孔间的差异不超过3倍。 结论 效应细胞、工作菌种、补体及血清样本的检测结果均符合阿拉巴马大学参考方法的标准要求，成功建立了基于MOPA的功能性抗体检测方法。 　　[关键词] 肺炎链球菌；疫苗；功能抗体；调理吞噬试验 　　[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）07（b）-0004-05 　　肺炎链球菌可以引起肺炎、菌血症、脑膜炎、中耳炎等疾病，是儿童和老年人获得性感染的主要病原菌[1]；接种肺炎链球菌疫苗可以有效预防肺炎链球菌感染[2]。为了保证疫苗质量，所有肺炎链球菌疫苗上市前均需对其免疫保护效力进行测定。目前针对该疫苗，普遍采用的体外效力检测方法是酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），利用抗原-抗体的特异性结合特性对待测血清中的抗体水平进行检测[3]；但该类方法只能检测抗体的总含量，无法将功能性抗体甄别出来，不能真实反映疫苗的免疫保护效果。事实上，对于一些特殊人群，如老年人和免疫系统不完善的人群，接种疫苗后产生的抗体往往是非功能性抗体，不能发挥免疫保护作用[4-5]。可见，如果单纯以抗体含量来评估疫苗质量，很可能无法准确鉴定疫苗的保护效力。因此，迫切需要建立能够准确反映功能性抗体含量的检定方法，以便能够正确评估肺炎链球菌疫苗的保护效力和质量。 　　肺炎球菌疫苗的保护机制主要是通过特异性抗体介导的调理吞噬作用将体内的肺炎球菌清除。所谓调理吞噬作用是指抗体、补体与吞噬细胞表面结合，促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用。由此可见，注射疫苗后只有机体产生能够有效介导调理吞噬作用的功能性抗体，才能发挥真正的免疫保护作用。通过体外调理吞噬实验（opsonophagocytic assay，OPA）检测抗体的调理吞噬活性，能够直接反映功能性抗体含量，实现对疫苗保护效力的准确评估[6]。已有多项研究表明，OPA与疫苗临床有效性的相关性要高于ELISA[7-8]。 　　近年来，国际上多个实验室开始致力于OPA技术的研发，试图建立一套稳定、可靠、标准化的检测方法。美国阿拉巴马大学通过长期探索，建立了优化的多重调理吞噬实验（multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA），可同时对4种血清型的肺炎球菌功能抗体进行检测，简化了实验流程，减少了工作量并节约血清样本，提高了OPA技术的检测通量[9]。并且国外部分药企已经开始采用OPA方法进行肺炎链球菌疫苗的临床效力评价[8，10-11]。但由于该方法操作较为复杂，技术要求高，目前国内该方法的研究和应用比较缺乏。本研究参考美国阿拉巴马大学大学的MOPA实验，结合国内的实际情况，旨在建立一套适合我国应用的肺炎链球菌疫苗效力评价方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　HL-60细胞系购自美国ATCC（CCL-240）；13个血清型的肺炎链球菌菌株（带有特定抗生素抗性）来源于美国阿拉巴马大学伯明翰分校Moon H Nahm实验室；5份血清样本来源于23价肺炎球菌多糖疫苗免疫后的健康人群；SPF级新西兰乳兔（3～4周龄）由中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室提供。 　　1.2 试剂 　　BactoTMTodd Hewitt Broth（THB）（批号：3071477）、酵母提取物（批号：2220095）购自Becton Dickinson公司；RPMI1640（批号：1393807）、胎牛血清（批号：1428479）购自Gibco公司；二甲基甲酰胺（DMF）（批号：3345C432）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（批号：2532B313）购自Amresco公司；Anti-CD11b PE（批号：2184659）、Anti-CD35PE（批号：2326940）、Anti-CD71 PE（批号：2292633）、Annexin V FITC（批号：2202518）、Propodium Iodide