分生B 重组DNA技术 20160405.ppt

* * * * （二）PCR鉴定 根据扩增的PCR产物片断大小进行判断 引物的特性： 1.特异性引物：根据插入片断设计的引物 2.通用引物：载体上带有一些常用引物(T7,SP6) 1.8kb 1.5kb 1.0kb 500bp 700bp M S1 S2 S3 * （三）核酸杂交法 原位杂交 Southern印迹 原位杂交 * （四）免疫学方法 用特异性的抗体检测基因的表达产物 Western Blot Immunocytochemistry * （五）DNA序列测定 质粒 　PCR 产物 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 * 第七节 克隆基因的表达 * 表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 * 一、 原核表达体系 E.coli表达体系最为常用 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 培养条件简单、低成本 增殖迅速，20-30分钟传代一次 实验室应用株安全缺陷株 基因组图谱已阐明 表达水平通常高于真核表达系统 * E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白 * 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、不经济 转染：将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 二、真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞 * 第八节 重组DNA技术的应用 * （一）构建基因组文库 (Genomic library) 基因组DNA的提取和有限酶解 基因组文库载体的构建 一、构建基因文库(gene library) （二）构建cDNA文库 (cDNA library) 包含一种生物的某种细胞在特定状态下表达的全部基因的cDNA序列。 * （一）方法 寡核苷酸介导的定点诱变 Kunkel法 双链定点诱变 PCR定点诱变 二、基因定点诱变 （二）应用 改造基因 改造载体 * 激素 细胞因子 生长因子 基因工程疫苗 基因工程抗体 三、基因工程药物 * 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 重组DNA技术的负面作用 生物安全： 致病性、实验室逃离、生态环境等 伦理学： 改造人到什么程度？ 生物武器？ 其它 * 电 子 克 隆 * 概念： 通过基因数据库进行序列搜索、对比分析、拼接整合、预测新的、假定的全长基因，然后通过分子生物学实验方法，加以证实，并从相应的组织、细胞中获得这种基因称为电子克隆(in silico cloning) 优点： 加快了新基因的发现速度，提高了工作效率 缺点： 基因数据库尚不完善，不是真正的基因克隆 * 本章重点 掌握以下概念：重组DNA技术；克隆；限制性核酸内 切酶；载体/克隆载体/表达载体；转化/转染/转导； 异源同裂酶/同尾酶 掌握DNA克隆的基本过程。 熟悉II型限制性核酸内切酶的特征。 熟悉载体的特性，常用的载体（尤质粒载体）的应用。 熟悉DNA的体外连接方法。 熟悉外源DNA导入宿主细胞的方法。 熟悉重组子的筛选鉴定方法。 * * Human insulin DNA is placed into the DNA of a second organism. The host organism becom