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陈皮对植物乳杆菌增殖培养条件优化 　　摘 要：以陈皮作为协同剂，采用L16（45）正交试验优化其对植物乳杆菌的增殖培养条件，结果表明，筛选出的最佳培养条件为培养温度35 ℃，培养时间30 h，接种量为1%（V/V），培养基初始pH值为8，陈皮的添加量为80 g?L-1，在此条件下培养，活菌数为1.86×1010 cfu?mL-1。 　　关键词：陈皮；植物乳杆菌；增殖 　　中图分类号：R284 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.08.010 　　植物乳杆菌作为一种益生菌因其代谢产物乳酸、细菌素及蛋白酶而广泛应用于畜禽生产中，它可以维持肠道菌群平衡，促进营养物质的消化和吸收[1-2]。 为了让乳酸菌更好地发挥作用，人们开展了协同剂的研究。目前研究的主要有寡糖、中草药和氨基酸。协同剂不仅能够提高乳酸菌的生存率，延长其作用时间，使乳酸菌以更大的数量到达体内，而且能刺激肠道内源性及外源性乳酸菌的定植和生长，此外还能够增强乳酸菌的代谢活性[3]。陈皮（Pericarpium citri Reticulatae）具有理气健脾、燥湿化痰作用，在临床用于胸脘胀满、食少吐泻、咳嗽痰多等症[4]。我国柑橘栽种面积居世界首位，产量位居世界第3。每年大量加工和消费柑橘的同时也产生数量惊人的桔皮（约占果质量的20%～25%）。而桔皮除少数用于制做中草药（陈皮）以及饲料外，大部分被抛弃或填埋，这不仅造成了饲料资源大量浪费，也严重污染了环境[5-6]。丁轲等[7]研究表明陈皮对乳酸杆菌的生长有促进作用。 　　因此，本研究拟对陈皮作为一种协同剂，优化其对植物乳杆菌体外增殖培养条件，为开发一种中草药和益生菌合生元提供生产技术参数。 　　1 材料和方法 　　1.1 材 料 　　1.1.1 菌种 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），天津市畜牧兽医研究所饲料微生物实验室保藏。 　　1.1.2 培养基 MRS液体培养基： 蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，柠檬酸氢二胺2 g，葡萄糖5 g，乙酸钠2 g，吐温80 1 g，磷酸氢二钾2 g，七水硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水1 000 mL。 　　MRS固体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，柠檬酸氢二胺2 g，葡萄糖5 g，乙酸钠2 g，吐温80 1 g，磷酸氢二钾2 g，七水硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 发酵条件 设计了L16（45）五个因素分别是温度、时间、接种量、pH值和陈皮添加量的四水平正交试验（表1）。 　　按正交试验设计表称取陈皮放入三角瓶中，加入MRS液体培养基至100 mL，混匀后调节pH值， 121 ℃ 20 min灭菌后分别按不同的接种量加入植物乳杆菌，进行不同发酵温度和培养时间的发酵培养。 　　1.2.2 计数方法 在1.5 mL离心管中加入900 μL无菌水，加入100 μL样品，分别稀释至10-5、10-6、10-7数量级，取100 μL涂平板计数，每个稀释度3个重复，37 ℃培养3 d计数。 　　1.2.3 数据分析 采用正交设计助手专业版v3.1。 　　2 结果与分析 　　根据表2因素的极差数值进行比较，发现接种量的极差数值最大，说明接种量对植物乳杆菌增殖的影响在5个考察因素中是最大的，5个因素极差大小顺序依次为接种量时间温度pH值陈皮浓度， 筛选出的最佳培养条件为培养温度35 ℃，培养时间30 h，接种量为1%，培养基初始pH值为8，陈皮的添加量为80 g?L-1，在此条件下培养，活菌数可达1.86 ×1010 cfu?mL-1。 　　3 结论与讨论 　　菌体生长是一个复杂的过程，众多因素都影响着菌体的生长状况，如温度、pH值、供氧强度、底物浓度、产物浓度等[8]。 　　培养基pH值对微生物的生长影响，主要是其影响菌体细胞膜电荷状况，引起膜渗透性的变化及影响营养物离子化程度，从而影响菌体对养分的吸收[9]。每种微生物都有一个适宜的pH值范围，而微生物细胞对pH值的改变是很敏感的，环境中的氢离子浓度如果超过了微生物的适应范围，就会降低抑制这些微生物的生命活动[10]。研究表明，pH值过高或过低对植物乳杆菌的增殖都存在不利的影响，pH值的变化会引起植物乳杆菌体内酶发生变化，从而影响细菌的生长[11]。本研究优化后的pH值为8。 　　温度高低与发酵液中的菌体生长速率、氧在培养液中的溶解度和传递速率密切相关，所以研究温度对菌体生长的影响非常必要[12]。微生物生长是一系列复杂化学反应的结果，而温度的改变必然影响生物体内进行的许多生化反应，菌体合成和