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金属离子与氨羧类螯合配体键合特性研究 　　摘要利用前沿色谱法，通过Cu2+、Ni2+和Co2+与螯合配体IDA 键合的准确度（R20.98）与精密度（RSD AspGlu；金属离子对螯合配体键合强度遵循Cu2+Ni2+Co2+；3种键合缓冲体系中，NaAcHAc键合效果最好。按照M06/6311++G （d， p） 方法对螯合配体与金属离子的结合能（ΔE）与吉布斯自由能（ΔG）进行相关的量子计算。根据ΔE 与ΔG 的大小，从理论上推测出螯合配体与金属离子的键合规律，此规律与上述实验结果基本相符。本研究为金属离子与螯合配体间键合参数的求取提供了有效的方法和手段，从而为今后提高IMAC柱的稳定性，解决固定金属亲和柱在应用过程中尤其是竞争洗脱过程中金属离子的流失问题奠定了良好的基础。 　　关键词前沿色谱法； 量子计算； 氨羧类螯合配体； 络合稳定常数； 总键合位点数 　　1引 言 　　自1975 年Porath 等[1]提出固定金?倮胱忧缀蜕?谱（Immobilized metal affinity chromatography，IMAC）的概念以来，该技术在蛋白质的分离纯化中得到了广泛应用[2，3]。该方法利用螯合物中固定化的金属离子与蛋白质间的亲和作用，实现目标的分离和纯化[4]。相对于传统的蛋白质分离技术，IMAC 对目标蛋白具有高度的选择性。此外，与其它亲和色谱相比，蛋白质负载量高，更容易实现工业化[5]。然而，金属离子的泄漏是IMAC 柱在实际应用过程中的致命缺陷[6，7]。该泄漏一方面与外部洗脱条件有关，另一方面与IMAC 柱自身即金属离子与螯合配体的键合强度有关，后者起主导作用。键合强度越高，键合稳定常数KML 越大，则IMAC 柱越稳定，在蛋白质竞争洗脱时金属离子越不容易泄漏。因此，建立一种快速准确测定键合强度的方法尤为重要。根据测得的键合参数可有效制备出高强度IMAC 柱，从而缓解甚至解决IMAC 柱上金属离子的流失问题。 　　键合稳定常数KML和总键合位点数Λ0直接体现金属离子在螯合配体上的键合特性。KML和Λ0的传统检测方法存在诸多不足[8～13]。前沿色谱法（Frontal chromatography，FC）能够在动态条件下同时测定溶质分子在配体上的KML和Λ0值，广泛应用于分子生物、药物机理和药物先导化合物的筛选研究[14～16]。在本课题组前期工作中，提出用FC法进行IMAC柱上KML和Λ0值的测定，结合均匀设计实验，制备出高稳定性能的GluCu柱[17]。 　　IMAC 柱的稳定性主要同金属离子与螯合配体的键合强弱有关，而键合强弱又与金属离子、络合配基及键合溶液相关。因此，采用FC 法测定IMAC 柱上键合参数是否具有普适性，是本研究的工作重点。根据IMAC 固定金属离子的选择原则（金属离子既要具有适宜的空轨道数目与螯合剂结合，还要有剩余的轨道亲合待分离的蛋白质），本研究以常见的过渡金属离子Cu2+、Ni2+和Co2+为代表，分别考察了在NaAcHAc、NaPB、TrisHCl 的键合溶液体系下，金属离子与IDA、Glu、Asp 的键合参数KML和Λ0。通过分析不同条件下键合参数的变化规律，以及与量子计算结果的比较，论证了方法的可行性。 　　2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　AKTA purifier10 生物色谱制备仪（Amersham Biosciences公司）；124PP 装填机（日本Chemico公司）；纯水仪（西安优普仪器设备公司）。 硅胶（粒径7 μm，孔径30 nm，兰州物理化学研究所）；γ缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（γGLDP，分析纯，辽宁盖县化工研究所）；亚氨基二乙酸（IDA，分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）均为分析纯；实验用水为超纯水（18.25 MΩ?cm）。 　　2.2固定相的制备 　　按照文献[6]分别制得IDA硅胶填料、Asp硅胶填料和Glu硅胶填料。采用匀浆法，将上述不同螯合配体硅胶填料分别装填至规格为50 mm × 4.6 mm的不锈钢柱内，在40 MPa 的压力下装填12 min， 依次得到IDA硅胶柱、Asp硅胶柱和Glu硅胶柱。 　　2.3KML和Λ0的测定 　　2.3.1空白突破曲线的测定用5.00 mmol/L NaNO225 mmol/L NaAcHAc 缓冲溶液（pH 4.0）以0.5 mL/min 的流速依次通过未键合金属离子的不同螯合配体硅胶柱，直至在356 nm 处的紫外可见吸收值达到一个平台，即得到空白突破曲线。 　　2.3.2金属离子突破曲线的测定用0.30 mmol/L CuSO425 mmol/L NaAcHAc 缓冲溶液（pH 4.0）以0.5 mL/min