鞘磷脂―胆固醇为膜材绞股蓝总皂苷脂质体制备及其质量评价研究.docVIP

鞘磷脂―胆固醇为膜材绞股蓝总皂苷脂质体制备及其质量评价研究 　　[摘要] 目的：探讨用鞘磷脂与胆固醇制备绞股蓝总皂苷脂质体的可行性，并获得最佳制备工艺与处方。方法：以鞘磷脂和胆固醇为膜材制备绞股蓝总皂苷脂质体；脂质体以鱼精蛋白沉淀法进行包封率的测定；以包封率为评定指标，筛选该新型绞股蓝总皂苷脂质体的最佳制备方法；用正交设计优化该脂质体的制备工艺；用粒径、电位、AFM电镜表征该新型绞股蓝总皂苷脂质体。结果：用鞘磷脂和胆固醇制备绞股蓝总皂苷脂质体的最佳制备方法为乙醇注入法，通过正交设计得最佳工艺为绞股蓝总皂苷与鞘磷脂质量比为1∶10，鞘磷脂与胆固醇的比例4∶1，缓冲液pH 7.0，水化温度45 ℃，包封率79.06%，粒径191.4 nm，电位-33.16 mV，电镜下呈规则圆形。结论：用鞘磷脂与胆固醇制备绞股蓝总皂苷脂质体方法可行，采用最佳工艺制备的绞股蓝总皂苷包封率高，形态和粒径均较好，重复性好。 　　[关键字] 绞股蓝总皂苷；脂质体；胆固醇；制备工艺；正交设计 　　[收稿日期] 2013-04-14 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目；江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室项目（JLCBE09021）；盐城师范学院自然科学基金项目（09YCKL010）；盐城师范学院教研项目（13YCTCJY046）；盐酸师范学院博士科研究启动基金项目 　　[通信作者] 喻樊，讲师，博士，Tel：（0515E-mail：pharmyufan@163.com 　　脂质体由于具有靶向、缓释、增效、减毒等优点，已成为是中药靶向制剂领域中最受关注的热点之一[1]。脂质体由磷脂和胆固醇构成，磷脂包括甘油磷脂和鞘磷脂2大类。人们对甘油磷脂研究的较多，如卵磷脂，而对结构与卵磷脂相似、同样由亲水亲油基团构成的鞘磷脂研究相对较少。鞘磷脂也能构成生物膜，且它占红细胞膜外膜磷脂含量的一半以上。由于鞘磷脂形成的是细胞外膜，比形成细胞内膜的卵磷脂更加牢固，有更好的刚性、更低的离子渗透性和对血浆的高度耐受性[2-3]。已有文献报道，鞘磷脂构成的脂质膜比普通细胞膜在血液中更为稳定[4-6]，鞘磷脂构成的脂质体还能延长药物在血液循环中的半衰期，具有长循环的特性[7-8]，因此对鞘磷脂构成的脂质体开展深入研究很有必要。 　　绞股蓝总皂苷（gypenosides）对肝癌、肺癌、食道癌、子宫癌、腹水癌、血癌、皮肤癌等20多种癌细胞有明显的抑制力[9]。绞股蓝总皂苷对肿瘤的抑制作用，除了直接杀伤瘤细胞，增强机体免疫功能也是其发挥抗肿瘤作用的重要途径，其抗肿瘤机制多样[10-13]、抗肿瘤作用的靶点和途径广泛[14-15]，体现了中医药治疗疾病的特点，具有很好的开发应用前景[16]。 　　本研究选用稳定性较好和具有长循环功能的鞘磷脂为膜材制备新型的绞股蓝总皂苷脂质体，以期用于肝炎、肝癌的治疗，达到减少给药次数和用药量，提高病人顺应性等目的。 　　1 材料 　　Zetaplus laser particle size analyzer（Malvern）；Model RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生物仪器公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；HZQ-X280恒温振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂）；BS210型电子天平；WFJ2000可见分光光度计；KBS-150型数控超声波细胞粉碎机（昆山市超声仪器有限公司）；SCZL-A型数字智能控温磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）；数显恒温水浴锅HH-2（国华电器有限公司）；AFM（Veeco公司）。 　　胆固醇（阿拉丁，批号47269）；绞股蓝总皂苷（陕西昂盛生物医药科技有限公司，批；鱼精蛋白（Sigma公司，批号P4672）；绞股蓝皂苷对照品（阿拉丁，批号D100246）；香草醛（上海晶纯实业有限公司，批号v100115）；鞘磷脂（Sigma公司，批号E1028）；其他试剂为分析纯。 　　2 方法与结果 　　2.1 绞股蓝总皂苷脂质体（鞘磷脂-胆固醇）的制备方法筛选[17] 　　2.1.1 乙醇注入法 称取绞股蓝总皂苷12 mg、鞘磷脂60 mg、胆固醇30 mg于100 mL烧杯中，加入乙醇20 mL使之完全溶解。取pH 7.0的磷酸盐缓冲液（PBS）20 mL，预热到45 ℃，搅拌下用针头匀速注入烧杯中，恒温搅拌2 h以除去乙醇，冰浴条件下探头超声10 min（超声时间2 s，间隔时间2 s，功率100 W），过0.45 μm微孔滤膜即得绞股蓝总皂苷脂质体[18]。 　　2.1.2 薄膜分散法 称取绞股蓝总皂苷12 mg，加入PBS 20 mL，混匀，备用。称取鞘磷脂60 mg、胆固醇30 mg，溶于乙醚25