重组人gdnf在人乳腺肿瘤上皮细胞中表达研究.docVIP

重组人gdnf在人乳腺肿瘤上皮细胞中表达研究 　　摘要：为了在人乳腺肿瘤上皮细胞系中表达重组人胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），本研究构建了牛β-casein基因启动子驱动的重组人GDNF乳腺上皮细胞特异表达载体，用脂质体介导法将其导入人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37细胞中，经G418抗性筛选8～10 d后，分离稳定表达红色荧光蛋白的转染细胞，PCR鉴定转基因细胞，用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞，RT-PCR和Western Blot检测重组人GDNF的表达分泌。结果表明：重组人GDNF乳腺上皮细胞特异表达载体被成功构建，转染Bcap-37细胞后，稳定整合到细胞染色体中，转基因细胞经激素诱导后能够表达分泌糖基化的 GDNF，为高效制备与天然人GDNF蛋白结构完全一致的重组人GDNF蛋白用于帕金森病临床治疗研究奠定了基础。 　　关键词：人乳腺肿瘤上皮细胞系；生物反应器；胶质细胞源性神经营养因子；表达载体；帕金森病 　　中图分类号： Q789文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0016-04 　　收稿日期：2014-07-23 　　基金项目：国家自然科学基金（编号；内蒙古高等学校科学研究项目（编号：NJ10184） 。 　　作者简介：张学明（1970―），男，内蒙古包头人，博士，副教授，主要研究方向为重组药物蛋白。E-mail：byzhxm@126.com。帕金森病（Parkinsons disease，PD）是老年人群中常见的一种神经元退行性疾病，其临床表现主要是以静止性震颤、运动迟缓、肌僵直和姿势平衡障碍为特征。PD的病理特征主要是中脑黑质多巴胺能神经元退行性丧失，导致纹状体中多巴胺含量显著降低[1]。目前用于PD临床治疗的常规药物主要有复方左旋多巴、多巴胺受体激动剂、抗胆碱能药物等，这些药物能够暂时减轻或缓解症状，但不能阻止PD的进程，且长期用于PD治疗会出现多种并发症[2]；因而，研制开发新的药物用于PD的有效治疗是非常必要的。 　　胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-direved neurotrophic factor，GDNF）是由Lin等于1993年在B49神经胶质瘤细胞中分离纯化出的一种分泌性糖蛋白，属于TGF-β超家族成员[3]。研究表明，GDNF对多巴胺能神经元具有营养及保护作用[4]，应用GDNF治疗帕金森病已进入二期临床研究[5]。然而由于GDNF在人和动物体中含量低，从动物组织中分离纯化GDNF用于疾病动物模型和临床实验研究是不现实的；因而，应用转基因技术大量生产重组GDNF用于疾病动物模型和临床研究具有潜在的重大社会效益和经济效益。 　　本研究构建了牛β-casein基因启动子驱动的人GDNF基因乳腺上皮细胞高效特异表达载体，转染人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37细胞，获得了能够表达重组人GDNF蛋白的转基因Bcap-37细胞系，为高效制备与天然人GDNF蛋白结构完全一致的重组人GDNF蛋白，并将其用于帕金森病临床治疗的研究奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　大肠杆菌DH5α、pP40R、pCMV-Red、pUC-gdnf为内蒙古科技大学包头医学院医学生物化学实验室保存。 　　质粒提取试剂盒（QIAGEN公司）、小量RNA提取试剂盒（上海舜华生物工程有限公司）、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN公司）、DNA纯化试剂盒（TIANGEN公司）。 　　Taq Plus、Pfu DNA聚合酶购自TIANGEN公司；T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、M-MLV反转录酶、Oligo（dt）、限制性内切酶均为TaKaRa产品。 　　人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37购自中国科学院上海细胞研究所；RPMI-1640、催乳素、氢化可的松、胰岛素购自Sigma 公司；兔抗人多克隆GDNF抗体（Rabbit Polyclonal GDNF Antibody）购自Santa Cruz公司；连接了碱性磷酸酶的羊抗兔二抗（Goat Anti-rabbit Second Antibody Conjugated with Alkaline Phosphatase）及 BCIP/NBT 试剂盒购自博士德公司。 　　1.2试验方法 　　1.2.1重组人gdnf乳腺特异表达载体的构建根据Bonsing等发表的牛β-casein基因序列（M55188）[6]设计PCR上游引物：5′-TCTGGGCCCGAAAAGGGAAATGTTGAATGGGAAG-3′，下游引物：5′-GGCCTCGAGCTCCTGGGAATGGGAAGATGA-3′，上下游引物两端分别引入ApaⅠ和XhoⅠ 酶切