针刺血清降低大鼠培养心肌细胞内Ca2含量研究.docVIP

针刺血清降低大鼠培养心肌细胞内Ca2含量研究 　　[摘　要] 目的：探讨针刺作用的机理中是否存在着体液因素。方法：取新生大鼠心肌细胞进行原代培养。5天后应用荧光分子探针Fluo-3AM染色。激光共焦扫描显微镜动态扫描观察；加入正常血清和电针刺“内关”“间使”的血清后，观察心肌细胞内Ca2+含量的变化。结果：加入正常血清后，细胞内的Ca2+含量会有一定程度的升高，经过十段时间后升高的2+含量会趋向平稳；而再加入针刺血清后，可明显降低心肌细胞Ca2+的含量(P＜0.01)。结论：针刺腧穴后的大鼠血清可使心肌细胞内Ca2+含量明显降低，为针刺效应的血清学机制提供了直接证据。 　　[主题词] 细胞，培养的／针灸效应；心肌／病理学；钙／代谢 　　针灸治疗冠心病具有整体调节作用，但以往大多数研究多注重神经系统对心脏的调控作用，而针灸作用的体液机理的研究则较少。自上世纪末针灸专家陈汉平教授提出“针灸血清”学说，血清所介导的针刺效应日益受到人们的关注。最近，笔者通过针刺血清对培养细胞影响的研究，发现针刺血清可明显降低培养神经细胞内升高的Ca2+含量[1]。另外，以往笔者针刺治疗大鼠心肌缺血的电镜研究，看到肌浆网(SR)Ca2+通道蛋白的电子密度明显增高，提示针刺可能对心肌细胞内Ca2+有调节作用[2]。尤其针刺血清对神经细胞内Ca2+含量直接调节作用的发现，无论对深入探索针灸治疗心脑血管疾病的机理，还是对利用开发血清中介导针刺效应的物质以提高临床疗效，均具有重要意义。本研究采用针刺大白鼠心经穴后收集的血清，观察其对体外培养的心肌细胞内Ca2+含量的影响，为探讨针灸作用机理中的体液因素提供直接的证据。 　　1 材料与方法 　　1．1 材料 　　新生SD乳鼠(级别SPF，许可证编号：SCXX)心肌培养细胞。荧光分子探针：Fluo-3AM(美国分子探针公司)；测试仪器：激光共焦扫描显微镜ACAS 575UV(美国MERIDIAN公司)单通道，动态扫描观察。 　　1．2 方法 　　(1)正常血清和针刺血清的制备 　　采用Wistar大鼠16只(320～410 g)，雌雄不拘，将实验动物随机分为两组，对照组、电针缺血组。 　　电针缺血组：以1．5％氯醛糖和20％氨基甲酸乙酯的混合液进行腹腔麻醉，开胸暴露心脏，于冠状动脉前降支下穿线结扎，RM―6000生理记录仪连接PowerLab实验软件进行监控记录，以ST段明显抬高，为实验动物心肌缺血模型成立。然后电针“内关”“间使”30 rain，刺激参数：1～3 mA，2～15 Hz，连续波。针刺治疗后，ST段回落明显。针刺缺血组ST段的回落说明针刺缓解了心肌缺血状况，针刺治疗模型成功有效。 　　对照组动物只做麻醉和心电记录30 rain。 　　实验结束后立即对两组动物进行心脏采血，每只动物约3 mL。血液静置后离心，分离出血清，分装后冷冻保存备用。 　　(2)心肌细胞的培养 　　取出生2天的乳鼠，75％酒精消毒后，在无菌操作台中切开胸部，剪取心肌组织，切成2～3 mm大小的碎块，放人消化液：0．125％胰酶加0．05％胶原酶Ⅱ型(PBS加10％葡萄糖)消化30 min后，轻轻吹打，使其分成单个细胞，加入细胞培育液(dulbeecosminimumessential medium，DMEM)，细胞密度为10×105放人CO2细胞培养箱培养5 d。相差显微镜下观察，选取有收缩波动和生长良好贴壁的心肌细胞平皿进行观察。 　　(3)Fluo-3AM活细胞染色 　　Fluo―3AM是以钙的鳌合剂EDTA为基础合成的一种新型的荧光分子。其主要特点是游离状态无荧光，当与游离Ca2+结合后荧光强度增强50～100倍。染色前，先将培养5 d的心肌细胞培养液更换成PBS缓冲液，然后将Fluo―3AM溶液(5μg／mL)加人心肌细胞培养皿，于37℃温箱孵育30 min，PBS冲洗后，将培养皿置于激光共焦显微镜的载物台上，在激光共焦扫描显微镜下进行动态观察。实验共观察10个平皿样本，对同一样本内加入不同的血清刺激物进行自身的前后对照，每30s1帧，前5帧为前对照；5帧后应用蠕动泵加入终浓度为10％正常血清，动态观察25帧；之后蠕动泵抽出再加入终含量为10％针刺血清，继续观察25～30帧。 　　(4)统计学处理 　　实验数据用均数X±5表示，分析采用t检验(t―test)。 　　2 观察结果 　　荧光分子探针Fluo―3AM染色后激光共焦显微镜下(激发光波长488 nm，吸收光波长514 nm)可见清晰的心肌细胞荧光影像，胞质内有一明显Ca2+高反应区。具体观察结果见表1、图1～图3。在正常静息状态下(前对照组)，细胞内Ca2＋含量变化的动态观测过程中，可见细胞内Ca2+含量基本保持在一个相对稳