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长梗蕉SSR标记研究 　　摘要 以云南野蕉（Musa.bilbisiana Colla）为实验材料，应用选择性扩增微卫星（SAM）法分离、克隆50个DNA序列，其中20个非重复，可用。一共20个序列用于特异引物的设计，再从20个序列的23个基因座设计出23对特异引物。研究表明：所采用的开发SSR标记的方法不仅简便、效率高且成本低。此外，5′锚定引物的简并性，引物与设计的特异引物配对后，部分引物对在进行检测时扩增得到的条带不清晰且稳定性较低。 　　关键词 长梗蕉；香蕉；SSR标记；SAM法 　　 　　随着分子标记技术的出现，国内已有人采用RAPD、AFLP技术来研究香蕉品种的亲缘关系，而香蕉的SSR标记尚无相关的研究报道。与其他分子标记技术相比，SSR标记多态性主要依赖于基本单元重复次数的变异，而这种变异在生物群体中是大量存在的，并且其具有使用程序简便、快速、多态性高、重复性好、遗传信息量大、共显性遗传等特点，是进行群体遗传结构分析、构建遗传连锁图谱非常有效的工具。目前许多物种已有现成的SSR引物，对一般实验室而言，只需合成现有的SSR引物进行PCR扩增，即可分析DNA的多态性。但因为SSR标记具有种族特异性，必须采用特异引物进行PCR检测，故而存在一个引物开发的问题。 　　开发SSR引物的方法有几种：经典的筛选基因组文库的方法、微卫星富集法、STMS（sequence tagged microsatellite sites）、选择性扩增微卫星（selectively amplified microsatellite，SAM）等。其中，SAM是研制SSR标记的一种新方法，不仅能产生多基因座SSR指纹，而且有用的SSR的回收率高，只需合成1个特异引物，即可检测相应的多态性SSR基因座。与传统方法相比，操作过程简便，成本也大大降低，故以此方法为本研究的首选方法。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1植物材料 　　以云南野蕉（M.BB Group Yunnanyejiao)为实验材料，由徐碧玉副研究员课题组提供。 　　1.2所用试剂 　　大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α由本实验室保存。限制性内切核酸酶MseⅠ购自Biolabs公司；PstⅠ、dATP、ExTaq酶、T4ligas购自宝生物工程（大连）有限公司；pBS-T vector和UNIQ210柱式PCR产物纯化试剂盒购自Tigangen公司；Taq DNA polymerase购自Fermentas公司；所用接头、suppressor primer，adapter primer和5′锚定简并SSR Priner，其序列参照Hayden MJ等人的方法，由北京奥科生物技术服务有限公司合成。 　　1.3方法 　　1.3.1香蕉基因组DNA的提取与纯化。香蕉叶片基因组DNA提取参照CTAB法，提取的DNA采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计Eppendorf Biophotometer分析测定，待用DNA样品稀释至20 ng/μL后，置-20℃保存备用。 　　1.3.2SSR序列的分离。应用Hayden和Sharp的选择性扩增微卫星（SAM）法，从云南野蕉的基因组DNA中分离SAM片段，经回收、克隆、测序后，用SSR FINDER软件分析，获得SSR序列。引物的设计与合成：采用PrimerPremier5.0软件设计特异引物，引物设计参数为引物长度（15~25nt）、3′端稳定性（-5.5~-9.0kcal/moL）、引物Tm值（52～65℃）、C含量（45%~55%）、引物rating值（＞90）。引物设计完成之后，由上海生物工程技术服务有限公司合成。 　　1.3.3不同引物的Tm值的筛选及多态性引物的筛选。以云南野蕉的基因组DNA为模板，更换不同的特异引物，进行退火温度梯度筛选。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，48～58℃退火1min，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5 min 。退火温度梯度设置分别为：48.0℃，48.7℃，49.6℃，50.7℃，52.0℃，53.4℃，54.8℃，56.1℃，57.1℃，58.0℃。PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染方法参考张军等的方法。 　　 　　2结果与分析 　　 　　2.1SSR序列的分离 　　2.1.1SAM片段的分离、克隆与测序。以云南野蕉基因组DNA为底物进行MseⅠ+PstⅠ双酶切，酶切产物与接头连接之后通过抑制性PCR、预扩增和SAM 3轮扩增，然后进行5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将SAM产物分离开来，银染结果显示：12个泳道中，每个泳道都有3~10条清晰的带，大小在100~700bp之间，从所有的泳