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长顺绿壳蛋鸡PRL基因克隆及序列分析 　　摘要：采用特异性引物PCR技术获得长顺绿壳蛋鸡PRL基因，将其克隆至pGM-T载体，并对该序列进行测序分析。结果表明，长顺绿壳蛋鸡PRL基因全序列长度为690 bp，包含5个外显子和4个内含子，编码229个氨基酸。将长顺绿壳蛋鸡PRL基因与GenBank已公布的鸡、鸭、鹅、鱼等动物的PRL基因序列进行同源性比较，发现亲缘关系越远则同源性越低。 　　关键词：长顺绿壳蛋鸡；催乳素基因；克隆；序列分析 　　中图分类号： Q785文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）12-0082-03 　　收稿日期：2015-10-13 　　基金?目：贵州省科学技术基金（编号：黔科合J字[2011]2174）；贵州省农业科学院研究生创新基金（编号：黔农科合[创新基金]2010011）；贵州省动植物育种专项（编号：黔农育专字[2011]027）；贵州省农业科学院专项（编号：黔农科院院专项[2014]006号）。 　　作者简介：韩雪（1982―），女，江苏徐州人，硕士，助理研究员，主要从事动物遗传育种研究。E-mail：hanxue8855601@126.com。 　　通信作者：陶宇航，副研究员，主要从事家禽养殖研究。E-mail：1043694421@。 　　催乳素（prolactin，PRL）是动物垂体前叶嗜酸细胞分泌的一种多肽类激素，对哺乳动物的乳腺发育、泌乳、卵巢功能、维持妊娠、机体免疫等具有重要的生物学效应[1]。在家禽中，PRL是促进母禽就巢孵卵行为和调控生殖活动的关键激素[2]，就巢期间PRL表达量升高可抑制垂体促性腺激素的分泌，致使卵巢萎缩，排卵泡停止，最终终止产蛋[3]。很多物种PRL基因的cDNA或基因全序列已被测定，其转录产物在不同物种中高度保守。对人、鸡、鸭、鹅等动物的研究表明，PRL基因由5个外显子和4个内含子构成。禽类PRL前体含229个氨基酸，其中包括30个氨基酸的信号肽序列和199个氨基酸的PRL成熟蛋白[4]。 　　长顺绿壳蛋鸡因其产地地处贵州省长顺县而得名，是中国稀有的珍禽品种。长顺绿壳蛋鸡是在贵州省特定自然生态环境下，经长期自然选择和人工选择而形成的品种，具有耐粗饲、抗病力强、觅食能力强等特点。然而，长顺绿壳蛋鸡产蛋量低、就巢性强，严重限制了其产业化发展。以长顺绿壳蛋鸡为研究对象，克隆其催乳素基因并进行测序分析，为长顺绿壳蛋鸡品种资源的保护利用及其产蛋性能的提高提供依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　血样采自贵州省长顺县长寨镇新民村长顺绿壳蛋鸡纯种繁殖场，翅静脉采血，共采取30羽长顺绿壳蛋鸡的血样。所有母鸡均在相同环境下单笼饲养，采取的血样经EDTA抗凝剂抗凝，送至实验室于-20 ℃保存备用。 　　1.2方法 　　1.2.1DNA提取 　　采用血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取血样中的DNA。 　　1.2.2引物设计 　　根据GenBank已公布的禽、鼠等PRL基因序列，采用Primer 5.0软件在序列保守区设计引物，引物序列见表1，由北京鼎国生物技术有限公司合成。 　　1.2.3PCR扩增与测序 　　50 μL PCR反应体系为10×PCR Buffer 5 μL、dNTP（10 μm） 1 μL、Template 1 μL、primer-F（10 μm） 1 μL、primer-R（10 μm） 1 μL、rTaqDNA聚合酶（2 U/μL） 0.5 μL，最后采用ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52～47 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共50个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京鼎国生物技术有限公司进行克隆和测序。 　　1.3数据处理 　　将PRL基因5个外显子片段进行拼接，并采用GenBank数据库进行BLAST分析。同时，将cDNA序列翻译成氨基酸序列，确定正确的开放阅读框（open readingf rame，ORF）；采用DNAman软件（）对长顺绿壳蛋鸡PRL基因序列与GenBank数据库公布的其他动物PRL基因序列进行核苷酸、氨基酸序列同源性比较及生物信息学分析。 　　2结果与分析 　　2.1长顺绿壳蛋鸡PRL基因的PCR扩增 　　以长顺绿壳蛋鸡血总DNA为模板，利用5对特异引物分别进行PCR扩增，扩增产物与预期片段大小吻合，引物扩增结果见图1。 　　2.2重组质粒的酶切鉴定 　　将重组质粒导入大肠杆菌，经过蓝白斑和抗性筛选，提取阳性大肠杆菌并进行质粒提取，然后对质粒进行EcoRⅠ酶切鉴定。结果表明，重组质粒构建成