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集在线荧光分析连续流动反转录聚合酶链式反应快速扩增检测食源致病性轮状病毒 　　摘 要 采用含RNA反转录（Reverse transcription，RT）和在线荧光分析的连续流动聚合酶链式反应（??Poly-????merase?? chain reaction，PCR）微流控技术检测食源致病性轮状病毒。此RT-PCR微流控装置以加热铜块组成恒温带，以聚四氟乙烯毛细管微通道为反应体系构建而成。采用循环水冷却退火区，此装置能获得低至31 ℃的退火温度，而且温度控制及其稳定性良好，因而能满足不同PCR的要求。为了充分体现PCR微流控技术的优越性，在线荧光分析被用于检测PCR产物。当流速为7.5 mm/s时，轮状病毒RNA的cDNA扩增和在线荧光分析能在约12 min完成（扩增约10 min，在线分析约2 min）。在此集成化的RT-PCR微流控装置上，1 h可完成轮状病毒RNA的RT-PCR以及其扩增产物的在线荧光分析，样品检出限达到6.4×10??4 copies/ 　　??@ L。 　　关键词 连续流动反转录-聚合酶链式反应； 在线荧光分析； 微流控技术； 食源致病性轮状病毒?? 　　 　　 　　1 引 言?? 　　胃肠炎是人类最常见的一种疾病。大多数胃肠炎是由病毒引起，其中轮状病毒是最主要的病原体之一。在感染轮状病毒人群中，婴幼儿成为主要群体，其中多数表现为严重急性腹泻，全球每年由此造成约60万5岁以下儿童死亡，其中80%以上在发展中国家。在我国，每年秋冬季是婴幼儿腹泻的高发期，这些病例中40%～60%是由轮状病毒引起。轮状病毒主要通过粪-口途径传播，随粪便排出体外后进入水体环境，在生活污水以及受污染地表水中广泛存在。它对水环境安全以及人类健康已构成严重威胁。因此，建立准确快速的检测方法具有重要意义。?? 　　 　　目前，检测轮状病毒的方法有电镜观察、细胞培养、核酸杂交、酶联免疫及聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）。电镜观察具有直接、可靠等优点。它可分为超薄切片法、负染法以及免疫电镜法。前两者方法操作复杂、费时、敏感性低，需要的病毒量较多。免疫电镜法是一种高度精确、灵敏的方法，但是其操作过程复杂，且价格昂贵。对于细胞培养法，其操作过程复杂、所需时间长、特异性不强。目前，快速灵敏的分子生物学方法已用于轮状病毒检测，主要是反转录PCR（Reverse transcription PCR, RT-PCR）。为了提高检测灵敏度和特异性或者检测通量，经典RT-PCR已经发展成RT-巢式-PCR（RT-nested-PCR）、实时定量RT-PCR（Real-time RT-PCR）以及多元RT-PCR（Multiplex RT-PCR）。然而，这些RT-PCR一般都在传统PCR仪上进行。传统PCR通常存在热容较大、热循环时间长、能量消耗高、空间体积大、集成化程度低等不足。微流控PCR自20世纪90年代初就已经引起人们关注，并且在核酸扩增分析领域日益受到重视。?? 　　微流控PCR可分为两种结构形式：微池静态PCR和连续流动PCR。前者是传统PCR微缩化，反应液固定在微反应池中，反应时间和能量消耗仍受系统热容所限制。为了取得较快的热循环速度和较小的能量消耗，系统热容通常需要精确优化。在连续流动PCR中，反应液在微通道中连续流动，往复通过2或3个恒温区，从而实现快速热循环扩增。连续流动PCR可分为下面几种：蛇型通道单向流PCR、直通道振荡流PCR、平面/柱面上螺旋通道单向流PCR以及闭合圆环通道单向流PCR。前两种连续流动PCR的温度带布置一般为：高温解链→中温延伸→低温退火，具有平滑的温度梯度优点，但是已解链的单链DNA经过延伸温度区时可能会与模板链或者其互补链结合形成双链而降低PCR效率。如果按照高温解链→低温退火→中温延伸布置时，在退火区将会需要强制性冷却而不是加热，这样会使系统结构复杂。3个温度带呈圆形布置能成功解决该问题。然而，3个温度带呈圆形布置的螺旋通道或者闭合圆环通道单向流PCR中，很少将RNA反转录以及在线荧光分析集成到连续流动PCR中。本研究是在前期研究的基础上，将RNA反转录和在线荧光分析两个单元功能集成到3个温度带呈圆形布置的螺旋通道连续流动PCR中，从而形成集RNA反转录、连续流动PCR扩增及在线荧光检测于一体的微流控装置，在该装置上成功进行了粪便中轮状病毒RNA的快速扩增检测。?? 　　2 实验部分?? 　　2.1 仪器与试剂?? 　　Mastercycler Gradient PCR仪和Biophotometer 生物分光光度计（德国Eppendorf公司）；KDS210注射泵（美国KD Scientific公司）；Gel Doc XR凝