预缺血通过NMDA受体抑制海马CA1区线粒体内细胞色素c向胞质释放研究.docVIP

预缺血通过NMDA受体抑制海马CA1区线粒体内细胞色素c向胞质释放研究 　　[摘要]目的 探讨脑缺血/再灌注、预缺血及预缺血前给予NMDA受体特异性抑制剂MK801对大鼠海马CA1区神经元线粒体内细胞色素c（Cyt c）向胞质释放的影响。方法 建立SD大鼠四动脉结扎全脑缺血及预缺血模型，给药组大鼠在预缺血前60 min给予腹腔注射MK801 3 mg/kg。将SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血/再灌注组、脑缺血/再灌注加生理盐水组、预缺血前给予MK801组、预缺血前给予生理盐水组和预缺血组。检测线粒体的标志蛋白COX Ⅳ在分离后的线粒体和对应胞质组分中的分布来证明实验中线粒体和胞质是否得到成功分离，利用免疫印迹法分析不同处理组大鼠海马CA1区神经元细胞线粒体组分以及对应胞质组分中的Cyt c和COX Ⅳ水平。结果 线粒体和胞质成功分离，COX Ⅳ只存在于各组的线粒体组分中，各组的胞质组分中均未检测到COX Ⅳ的免疫活性。脑缺血/再灌注组线粒体内Cyt c向胞质的释放与假手术组比较显著增加，差异有统计学意义（P0.05）。预缺血组与脑缺血/再灌注组相比，线粒体内Cyt c向胞质的释放显著降低，差异有统计学意义（P0.05）。预缺血前给予MK801组与预缺血组相比，线粒体中Cyt c向胞质释放显著增加，差异有统计学意义（P0.05）。结论 预缺血通过NMDA受体的介导抑制脑缺血/再灌注诱导增加线粒体内Cyt c向胞质的释放，为临床治疗脑缺血/再灌注性损伤提供了理论依据。 　　[关键词]脑缺血/再灌注；预缺血；细胞色素c；NMDA 受体；线粒体 　　[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）08（c）-0004-04 　　脑缺血/再灌注会引起严重的脑损伤，已成为21世纪三大致死性疾病之一，其内在机制的研究已被国内外学者广泛关注[1]，但是具体机制尚不明确。越来越多的证据表明，参与短暂性脑缺血引起的神经元死亡的线粒体通路与线粒体中细胞色素c（cytochrome c，Cyt c）的释放有关[2]，并且是受体介导的，但是短暂性脑缺血引发Cyt c释放的上游信号通路还不是很清楚。研究显示，脑缺血再灌注能增加Cyt c从线粒体向胞质的释放[3]。脑预缺血，即轻微、短时而不至于引起神经细胞死亡的缺血处理后，可使脑组织获得对再次足够强度缺血的耐受，并减少脑神经元损伤的现象，被称为脑缺血耐受[4-6]，又称预缺血，其在心脏和脑缺血性损伤中普遍存在。国内外的研究发现，以足够强度的亚致死性缺血刺激大脑后，大脑会在短时间内对后续的致死性缺血刺激获得短暂的耐受，并产生对脑缺血损伤的内源性保护作用。 　　N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）是中枢神经系统内一类重要的兴奋性氨基酸（excitatory aminoacid，EAA）受体[7]。NMDA亚型在兴奋性突触中是一种典型的配体门控离子通道，并且与缺血引起的神经元损伤有关[8]。功能型的NMDA受体包含NR1、NR2（2A-2D）、NR3（3A/3B）三个亚基[9-10]。NR1是NMDA受体发挥其通道活性的一个主要亚基，NR2亚基则决定受体的选择性。NMDA受体的过度激活被认为是缺血应激中的主要信号转变，但是温和地刺激NMDA受体则被认为可以在体外培养的小脑粒细胞神经元中诱导神经元对兴奋性中毒的保护[11]，温和地刺激NMDA受体的活性被认为与诱导缺血耐受有关[12]，而其如何导致神经保护作用的细胞信号转导途径还未研究清楚。 　　本实验通过对SD大鼠全脑缺血和预缺血模型的研究来揭示线粒体 Cyt c向胞质的释放在缺血耐受中的变化以及与NMDA受体的关系。给予SD大鼠3 min缺血作为预缺血，复灌3 d后给予6 min缺血作为致死性缺血，全脑缺血模型为给予SD大鼠6 min的缺血后复灌，并应用NMDA受体抑制剂MK801来探讨NMDA受体在缺血耐受形成中的分子机制。 　　1材料与方法 　　1.1实验动物和试剂 　　由本校实验动物中心和中科院上海实验动物中心提供的SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，250～300 g，自由进食，昼夜交替照明。将大鼠随机分为假手术组、脑缺血/再灌注组、预缺血组、脑缺血/再灌注加生理盐水组、预缺血前给予MK801组、预缺血前给予生理盐水组。兔多克隆抗Cyt c（#4272）和兔多克隆抗COXⅣ（#4844）购于Cell Signaling Technology公司，硝酸纤维素（NC）膜购于Amersham公司，NBT/BCIP购于Promega公司，牛血清白蛋白（组分Ⅴ）购于Amresco公司，工具药（MK801）和一些化学试剂