第1章DNA重组克隆单元操作.ppt

第1章 DNA重组克隆的单元操作 一、质粒 (一) 质粒的分布、大小、数目 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于某些真核细胞（酵母的2μ环状质粒）。 质粒DNA分子量范围为1—200×106Da。 一个细胞内的质粒数量变化也很大，有1至几个的，也有几十个的，甚至有数百个。 （这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有1个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有10-200拷贝数。） (二)质粒DNA的构型 三种不同的构型： 当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(ocDNA)。 若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为L构型。 (三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。 能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。 (四)质粒DNA的生物学特性 (1)寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。 (2)稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 (3)同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。 (4)重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 (5)不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 (6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。 (7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将其去除。 (8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。 (9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗性等。 (五)质粒的命名原则 1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。如pUC118, 字母p代表质粒，UC是构建该质粒的研究人员的姓名，118代表构建的一系列质粒的编号。 （六）组建理想质粒载体必须具备的条件 (1)质粒拷贝数较高 质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。 严紧型：低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid)； 松弛型：高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达10-60份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)。 (2)分子量较小 低分子量的质粒如下优点 (3)带有可供选择的标记 常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四环素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有若干单一的限制酶切点。 在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株，这样较易检查到克隆是否成功。 （七）常用的质粒载体 pSC101质粒载体是第一个成功用于克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体。 pBR322是用人工方法构建的符合理想质粒载体条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。 pUC质粒载体 (1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)； (2)氨卞青霉素抗性基因(Ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点； (3)大肠杆菌β-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端α-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ1基因； (4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠近5’端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏lacZ 基因的功能。 pUC18质粒载体 优点: (1)具有更小的分子量 (2)便于重组子的检测 pUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，在应用pUC18质粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。 (3)具有多克隆位点(MCS)区段 (2)表达载体 条件：一个强启动子及其两侧的调控序列; 有SD序列且该序列与起始密码于ATG之间要有合适的距离 在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源