鲶鱼体表黏液IgM分离纯化及其抑菌活性研究.docVIP

鲶鱼体表黏液IgM分离纯化及其抑菌活性研究 　　摘要：依次采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析法从鲶鱼体表黏液中分离纯化IgM，并对其抑菌活性进行了检测。通过试验可以得出，凝胶层析的最佳分离条件为：0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液、洗脱速度为0.3 mL/min。鲶鱼体表黏液中提取的IgM对大肠杆菌抑菌作用最强，其次是枯草芽孢杆菌，对藤黄微球菌抑菌效果最不明显。在低温贮存时温度控制在0～4 ℃，有助于保持其抑菌活性，但随着时间的延长，抑菌活性也会逐渐减弱。 　　关键词：鲶鱼；体表黏液；IgM；分离纯化；抑菌活性 　　中图分类号：S917.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0636-03 　　免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）能凝集细菌，中和病毒，并能在体内其他因素的参与下彻底杀死细菌和病毒，增强机体的免疫功能[1]。免疫球蛋白可用于食品的防腐保鲜，食品中病原菌、有毒成分和功能性成分的快速检测等[2]。国内外对鱼类免疫球蛋白的研究较多[3-6]，但关于鱼类黏液中免疫球蛋白抑菌活性方面的研究却很少。本试验对鲶鱼体表黏液中的IgM进行分离纯化，并对其抑菌活性进行了研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　鲶鱼取自天津市西青区杨柳青渔场。 　　SephadexG-200，Pharmacia公司产品；ELISA试剂盒，美国Adlitteram Diagnostic Laboratories公司产品；营养琼脂、牛肉膏、氯化钠、蛋白胨购自天津翔天科技有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）均由天津农学院基础部微生物实验室提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 鲶鱼体表黏液IgM的分离纯化 将鲶鱼皮用蒸馏水浸泡一段时间，搅拌，取上清液，用纱布将上清液过滤，去除较大的杂质，备用。取黏液后采用硫酸铵分级沉淀进行粗分离，然后再采用离子交换层析进一步分离纯化[7]。 　　离子交换层析后再采用凝胶过滤层析，分离参数选取如下：柱长70 cm，直径1.6 cm，流速0.3 mL/min，洗脱液分别为0.01 mol/L pH 8.0的PBS、0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl，每5 min收集1管，280 nm波长下检测，收集活性峰后冷冻干燥。将干燥后的样品配制成50 mg/L的溶液，采用ELISA试剂盒测定IgM浓度，计算纯度。选出最优洗脱液后，采用最优洗脱液进行后续参数选择。分别选取洗脱速度为0.1、0.3、0.6 mL/min，每5 min收集1管，280 nm波长下检测，收集活性峰后冷冻干燥。将干燥后的样品配制成50 mg/L的溶液，采用ELISA试剂盒测定IgM浓度，计算纯度。凝胶层析过程中，样品的吸光度越大IgM纯度越高。 　　1.2.2 鲶鱼体表黏液IgM抑菌活性的测定 分别选取革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，检测分离纯化后的IgM的抑菌效果。革兰氏阳性菌包括藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性菌为大肠杆菌。参照杨光等[8]的滤纸片法进行抑菌试验。 　　制备大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的菌悬液，在无菌操作台内进行抑菌试验操作。每种菌悬液分别接种3个培养皿，用无菌涂布器将菌悬液涂布均匀。将冷冻干燥后的IgM样品配制成浓度为1%、2%、3%、4%、5%的抑菌液，滤纸片分别在上述不同浓度的抑菌液中浸泡1 min，取出晾微干，空白对照不做任何处理，每个培养皿均匀放置6个滤纸片。然后将培养皿倒置于恒温箱中，37 ℃培养24 h，观察各培养皿的变化情况。 　　1.2.3 鲶鱼体表黏液IgM最小抑菌浓度（MIC）的确定 由试验1.2.2得出鲶鱼体表黏液IgM对大肠杆菌的抑菌效果最好，对枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的抑菌效果不明显，因此，针对大肠杆菌进行最小抑菌浓度试验。用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养大肠杆菌。将冷冻干燥后的IgM配制成浓度为0.13%、0.25%、0.50%、1.00%、2.00%的样品溶液。在各培养皿内分别加入2 mL不同浓度的样品溶液，每个浓度重复3次。向各培养皿内倒入15～20 mL培养基，轻轻摇动使其充分混匀。待冷却凝固后，向各培养皿内加入0.2 mL菌悬液，涂匀，用蒸馏水作对照。37 ℃恒温培养24 h，取出观察结果。以完全没有菌落生长的样品溶液最低浓度为最小抑菌浓度。 　　1.2.4 不同贮藏温度下鲶鱼体表黏液IgM的抑菌活性变化 试验共进行30 d。将冷冻干燥后的IgM配制成5%的样品溶液，分别贮存于0～4 ℃、20～25 ℃条件下，于1、8、15、22、29 d测定I