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鸡囊胚细胞玻璃化冷冻保存技术研究 　　摘要:研究不同冷冻液配方对鸡囊胚细胞的玻璃化冷冻保存效果。对新鲜种蛋囊胚细胞分离提纯后,在DMEM中添加不同的冷冻保护剂DMSO(二甲基亚砜)、EG(乙二醇)、蔗糖,分别组成6种玻璃化冷冻保护液,进行超低温冷冻保存。复苏后通过苔盼蓝染色测定活细胞存活率。结果:玻璃化冷冻保存中,囊胚细胞在玻璃化冷冻液配方2(10%EG+10%DMSO+0.5mol/L蔗糖+20%FBS+DMEM)条件下复苏后存活率最高(71.32%),与玻璃化冷冻液配方1和3条件下复苏后存活率之间差异显著(P0.05),且与玻璃化冷冻液配方4、5、6条件下复苏后存活率之间差异均极显著(P0.01),可以作为鸡囊胚细胞的玻璃化冷冻液。 　　关键词:鸡;囊胚细胞;玻璃化冷冻 　　中图分类号:S831.4+9文献标识码:A文章编号:1007-273X(2009)11-0007-03 　　 　　随着超低温冷冻保存技术的发展,许多哺乳动物及一些濒危动物的种质细胞(精子、卵子和胚胎)都实现了超低温冷冻保存,玻璃化冷冻技术因其简便、快速、经济,减轻了胚胎冷冻中常见的冻伤现象,存活率提高,因此应用日益广泛[1]。本实验采用玻璃化冷冻鸡X期囊胚细胞,并探讨此方法对鸡胚胎复苏效果,为家禽种质资源保存做基础性研究。 　　 　　1材料和方法 　　 　　1.1实验时间和地点 　　实验时间:2009年2月至2009年4月。 　　实验地点:湖南省畜牧兽医研究所生物技术研究室。 　　1.2材料 　　1.2.1种蛋种蛋来自湖南省畜牧兽医研究所生物技术研究室饲养的白莱航鸡。 　　1.2.2主要试剂DMEM(高糖,Gibco)、FBS(胎牛血清,杭州四季青公司生产)、DMSO(二甲基亚枫,Sigma)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮,Sigma)、EG(乙二醇,Sigma)、Sucrose(蔗糖,Sigma)。 　　1.3方法 　　 　　1.3.1鸡囊胚细胞的采集[2]在无菌环境中,将已消毒的种蛋打入培养皿中,使胚盘位置位于正上方。剪破并刮除胚盘上的浓蛋清,用消毒后的滤纸环轻轻贴在囊胚的位置,将粘有囊胚的滤纸环转入含PBS的培养皿。用头发环剔除蛋黄,切掉周围的暗区,保留中央的明区,再用 0.5% PBS清洗两次后待用。 　　1.3.2囊胚细胞玻璃化冷冻液和复苏液的配制冷冻液和复苏液的配制方法参考韩威等冷冻和复苏PGCs细胞的液体配制方法[3]。囊胚细胞慢速冷冻液由细胞悬液I和细胞悬液Ⅱ共同组成。细胞悬液I:DMEM+20%FBS;细胞悬液Ⅱ:无血清DMEM+冷冻保护剂(其中不同配方中,EG、DMSO和蔗糖的比例不同)。不同玻璃化冷冻液配方见表1。 　　1.3.3冷冻方法将PBS清洗过的囊胚细胞放入细胞悬液I中悬浮,轻轻吹打,同时缓慢加入等体积的细胞悬液Ⅱ,使其混合均匀。调整细胞密度为2～3×107个/mL,开始装管。采用0.25mL精液细管装胚,按顺序依次吸入0.5mol/L蔗糖溶液(5cm),首先抽取细胞悬液Ⅱ2.5～3.0cm,然后抽吸1.5～2.0cm空气柱。之后抽吸含胚胎的玻璃化冷冻液1.5～2.0cm,尽量使胚胎位于溶液中段。再抽吸1.5～2.0cm空气柱。最后抽吸细胞悬液Ⅱ至冷冻麦管末端,用电加热镊子封闭麦管。随即浸入液氮中冷冻保存。 　　 　　1.3.4复苏方法复苏液的配制:1.5mL离心管中加入1mL无血清DMEM液,再缓慢加入0.2mL FBS于离心管底部,制得解冻液,可见明显的分层,使用前37～38℃预热。 　　囊胚细胞复苏时,从液氮罐取出冷冻麦管,迅速投至37～38℃水浴中放置10s,用无菌剪刀剪开麦管两端,用注射器将冷冻麦管内胚胎缓慢的吹入复苏液的上层面,当细胞下沉到DMEM和FBS液面分界处,1 000r/min离心5min收集囊胚细胞沉淀,用细胞培养液悬浮囊胚细胞沉淀。 　　1.3.5细胞活率计算培养液中的悬浮囊胚细胞,转入6孔培养板中,细胞密度为2~3×104个/孔。37℃,5%CO2,饱和湿度条件下于CO2培养箱中培养2h后,采用台盼蓝对囊胚细胞进行染色后,计数染色的死细胞数和未染色活细胞数,并计算细胞存活率,以同期未冷冻的鸡囊胚细胞作为对照。 　　1.3.6形态学鉴定用倒置显微镜,观察培养4h后的囊胚细胞生长、集落形成情况及集落的外部特征。 　　1.3.7数据处理实验结果用SAS V8.01统计分析软件进行数据处理,检验方法采用X2检验。 　　 　　2结果与分析 　　 　　2.1细胞活率和台盼蓝染色结果 　　采用不同玻璃化冷冻液冷冻,复苏后囊胚细胞的存活率结果见表2,从表2可以看出,囊胚细胞玻璃化冷冻复苏后,在冷冻保护液1和冷冻保护液3条件下的活率分别为65.65%、61.