高灌蓝莓CBF基因单核苷酸多态性分析.docVIP

高灌蓝莓CBF基因单核苷酸多态性分析 　　摘要：本研究以21个高灌蓝莓品种为试材，克隆VcCBF基因，测序后分析其单核苷酸多态性（SNP），共克隆到123个非重复序列，发现120个SNP位点，单核苷酸多态性发生频率为1/695bp，核苷酸多态性值（Pi）为0.01251。在120个SNP位点中，单态突变位点62个；简约信息位点58个，其中双突变55个，三突变3个。对其碱基替换方式进行分析发现，转换91个，颠换26个，转换与颠换的发生比率为3.5∶1。通过单倍型分析发现，21个蓝莓品种的VcCBF基因存在5种单倍型。 　　关键词：CBF；单核苷酸多态性（SNP）；蓝莓 　　中图分类号：Q524+.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0008-03 　　CBF基因（也称为DREB1基因）编码一个具有AP2结构域的转录激活子，能够结合到CRT（C-repeat）或DRE（dehydration-responsive element）顺式作用元件上，调节植物冷适应相关基因的表达[1]。CBF基因是植物冷适应及信号传导领域最有意义的发现之一，多种与植物冷适应相关的基因都受其调控，目前已在多种重要的农作物及蔬菜中发现该基因[2～4]。Polashock等[5]从高灌蓝莓（Vaccinium corymbosum）品种蓝丰（Bluecrop）和兔眼蓝莓（Vaccinium virgatum） 品种梯芙蓝（Tifblue）中克隆到CBF基因并验证其功能，发现CBF基因表达量和表达模式的差异可能与品种间的抗寒性不同有关。 　　单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指在基因组水平上由单核苷酸变异引起的一种序列多态性[6]。在所有可能的DNA序列差异性中，单核苷酸多态性是发生频率最高的变异，人类90%左右的DNA序列多态性都是单核苷酸多态性[7]。单核苷酸多态性具有数量大、分布广、稳定性强、易于分型等优点，在人类疾病的诊断及治疗、致病基因的发现、族群的演化研究等方面起到了重要作用，同时在小麦、玉米、大豆等作物的物理作图、进化研究、遗传研究中也是有效的分子标记[6， 8～11]。 　　本研究以21个不同品种的高灌蓝莓为材料，克隆VcCBF基因，采用直接测序法筛查其单核苷酸多态性，以期为研究VcCBF基因与蓝莓抗寒性的关系奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　本研究所用的21个高灌蓝莓品种采自山东省果树研究所蓝莓品种资源圃，分别为伯克利（Berkeley）、喜来（Sierra）、陶柔（Toro）、都克（Duke）、日出（Sunrise）、蓝丰（Bluecrop）、埃利奥特（Elliott）、达柔（Darrow）、蓝塔（Bluetta）、泽西（Jersey）、布里吉塔（Brigitta）、早蓝（Earliblue）、晚蓝（Lateblue）、蓝金（Bluegold）、瑞卡（Reka）、佐治亚宝石（Georgiagem）、密斯提（Misty）、奥尼尔（O’Neal）、夏普蓝（Sharpblue）、罗卫（Reveille）和普鲁（Puru）。 　　1.2VcCBF基因的克隆、测序及单核苷酸多态性分析 　　以蓝莓幼嫩叶片为材料，采用TIANGEN植物基因组提取试剂盒提取基因组DNA， 根据已发表的蓝莓CBF基因序列设计引物进行PCR扩增。 扩增所用上游引物为5′-GAATCGTCGATGGAATATAACT-3′，下游引物为5′-TCTAAAATCTAACTCCACAACG-3′。PCR产物回收后采用pMD18-T载体（TaKaRa公司）连接，转化DH5α感受态细胞，在含有Amp的LB平板上培养过夜后，挑取菌落进行菌落PCR筛选阳性克隆，每个品种选取8个，送上海生工生物工程有限公司测序[12]，所得序列采用DnaSP v5软件分析[13]。 　　2结果与分析 　　2.1VcCBF基因的克隆 　　PCR所得目的片段长度为698 bp，编码区长681 bp，将测序结果进行比对，除去重复序列，共得到123个非重复序列，每个品种有4～8个，结果见表1。 　　2.2VcCBF基因的单核苷酸多态性分析 　　将得到的123个VcCBF基因编码区非重复序列用DnaSP v5软件进行单核苷酸多态性分析，结果见表2。共发现了120个SNP位点，全部为单核苷酸替换，没有InDel的情况发生，SNP的发生频率为1/695bp，核苷酸多态性值（Pi）为0.01251。在120个SNP位点中，单态突变位点（singleton variable sites）62个，简约信息位点（parsimony informative sites）58个，简约信息位点中，双突变5