黑水缬草提取物对阿尔茨海默病模型小鼠治疗作用代谢组学研究.docVIP

黑水缬草提取物对阿尔茨海默病模型小鼠治疗作用代谢组学研究 　　[摘要] 目的 运用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）探讨黑水缬草提取物对阿尔茨海默病（AD）的治疗机制。 方法 将雄性昆明小鼠分为3组，分别为对照组（2%吐温80）、AD模型组（2%吐温80）和治疗组（95%黑水缬草粗提物2 g/kg），灌胃给药30 d。运用Morris水迷宫实验和UPLC-MS技术对小鼠进行研究。 结果 Morris水迷宫定位航行实验显示，与对照组比较，AD模型组小鼠逃避潜伏期明显延长（P 0.05），治疗组小鼠逃避潜伏期明显缩短（P 0.05）。空间探索实验显示，与对照组比较，AD模型组小鼠单位时间目标象限停留时间短，穿台次数减少（P 0.05），治疗组小鼠单位时间内目标象限停留时间长，穿台次数增加（P 0.05）。通过UPLC-MS/MS技术，确定了10种AD的血浆生物标志物，分别为组氨酸、溶血磷脂酰胆碱C16∶0、溶血磷脂酰胆碱C18∶2、溶血磷脂酰胆碱C18∶1、溶血磷脂酰胆碱C20∶4、溶血磷脂酰胆碱C22∶6、十六碳鞘磷脂、二氢神经鞘氨醇、4-羟双氢（神经）鞘氨醇C18、4-羟双氢（神经）鞘氨醇C20，与对照组比较，AD模型组小鼠血浆中10种标志物的含量均明显降低，差异有统计学意义（P 0.05或P 0.01）。治疗组小鼠血浆中10种标志物的含量均明显上升（P 0.05或P 0.01）。 结论 黑水缬草提取物可提高AD小鼠的认知功能，其作用机制与氨基酸、磷脂和鞘脂代谢等相关代谢通路有关。 　　[关键词] 阿尔茨海默病；黑水缬草；代谢组学；生物标志物 　　[中图分类号] R749.16 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）07（c）-0004-04 　　阿尔茨海默病（AD）是一种起病隐匿的中枢神经系统受损性疾病，是最常见的痴呆类型[1]。随着人口老龄化，AD已成为致老年人死亡的第四大疾病[2]。黑水缬草（Valeriana amurensis）为败酱科缬草属植物，具有镇静、抗抑郁及抗心血管疾病等作用[3]，有研究表明黑水缬草具有治疗AD的功效[4]。本研究运用代谢组学技术研究黑水缬草提取物对AD的调控机制，为AD的防治提供新的思路。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂与仪器 　　黑水缬草由安国市瑞泰堂药材行提供；Aβ25～35由美国Sigma公司生产；色谱乙腈、色谱甲醇，购于美国J.T.Baker公司；TGL-16台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机有限公司，离心腔直径250 mm）；仪器为液相系统Waters AcquityTM Ultra Performance Liquid Chromatography（UPLC）System，质谱仪Micromass Quattro microTM API三重四级杆质谱仪，美国Waters公司。 　　1.2 实验动物 　　12周雄性KM小鼠24只，体重18～22 g，由沈阳药科大学实验动物中心提供，动物合格证号[SCXK（辽）2010-0001]。置于室温（25±2）℃，12/12 h昼夜循环光照条件下生活，自由摄食、饮水。 　　1.3 黑水缬草提取物制备 　　将500 g干燥的黑水缬草根及根茎粉碎成粗粉，以10倍体积的95%乙醇回流提取3次，每次2.5 h，滤过，回收乙醇液，减压浓缩，得150 g乙醇提取物，即黑水缬草95%粗提物。 　　1.4 AD模型制备 　　实验小鼠适应性喂养1周，运用完全随机方法，分为对照组、AD模型组和治疗组，每组8只。采用小鼠双侧侧脑室注射Aβ25～35蛋白的方法制备AD模型。小鼠麻醉后，双侧侧脑室（以前囟为起点，沿矢状缝后移0.5 mm，然后侧移1.1 mm，垂直进针3.0 mm）各缓慢注射3 μL聚合态Aβ25～35溶液，对照组双侧侧脑室注射等量生理盐水。 　　1.5 给药方法 　　造模后第3天开始灌胃，治疗组小鼠给予95%黑水缬草粗提物（用2%吐温80溶液做溶剂配成0.1 g/mL溶液）2 g/kg，AD模型组和对照组给予等量的2%吐温80溶液。每日1次，实验进行30 d。 　　1.6 Morris水迷宫 　　实验进行6 d，期间小鼠正常灌胃给药。前5 d进行定位航行实验，每日2次，观察小鼠的运动轨迹，若60 s内小鼠未寻到平台，则将其引导致平台，并在上面停留10 s。第6天进行空间探索实验，撤去水中平台，观察并记录小鼠60 s内穿越原平台所在位置的次数及在此象限的停留时间。 　　1.7 样品的采集与预处理 　　小鼠乙醚麻醉，去眼球取血置于1.5 mL离心管（EP内涂肝素），离心10 min（4℃，12 000 r/min），取上清液，置于-80℃冰箱保存。预处理