膜基质免疫分析法同时检测玉米中伏马菌素B1与呕吐毒素.docVIP

膜基质免疫分析法同时检测玉米中伏马菌素B1与呕吐毒素 　　摘 要 建立了基于聚偏氟乙烯膜（Polyvinylidene fluoride, PVDF）基质的直接竞争免疫分析法，同时检测玉米中的伏马菌素B1（Fumonisin B1, FB1）及呕吐毒素（Deoxynivalenol, DON）。PVDF膜用甲醇浸湿、激活，用移液器将 FB1及 DON 全抗原点阵于相应的膜反应区，同时采用三聚氰氯法和高碘酸钠法分别制备抗FB1、抗 DON 的辣根过氧化酶（Horseradish peroxidase, HRP）标抗体（monoclonal antibody, McAb），以直接竞争免疫检测方法的模式实现同时检测玉米中的 FB1及 DON。该方法对于 FB1和DON 的检出限分别为 2.5和50 　　?SymbolmA@ g/L，样品前处理简单，检测时间 15 min，可肉眼辨别结果，随机检测了 30 份市售玉米样品，并与市售 ELISA 试剂盒进行方法学比较，结果无明显差异。 　　关键词 聚偏氟乙烯膜； 伏马菌素B1； 呕吐毒素； 直接竞争免疫检测 　　 2011-06-24收稿；2011-09-22接受 　　本文系国家“863”计划项目（No.省略 　　1 引 言 　　伏马菌素（Fumonisins, FBs）是主要由串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）产生的水溶性代谢产物[1]，大多存在于玉米及玉米制品中[2]。FB1是其中的主要组分，占伏马菌素总量的 70%～80%[3]，也是导致伏马菌素毒性作用最主要原因。伏马菌素具有神经毒性[4]、免疫系统毒性[5]和致癌性[6]等。瑞典已确定玉米中 FB1和 FB?2的最大可接受限量为1 mg/kg[7]，我国尚未制定食品与饲料中伏马菌素的限量标准。 　　呕吐毒素是主要由禾谷镰刀菌（F.graminearum）和黄色镰刀菌（F.culmorum）产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物，是一种单端孢霉烯族化合物，常污染玉米、小麦和大麦等谷物及其制品[8]，具有免疫毒性[9]、胚胎毒性[10]和细胞毒性[11]。我国规定谷物及其制品中 DON 的限量为?1 mg/kg[12]。 　　真菌毒素的快速检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）[13,14]、基于 NC 膜的胶体金免疫层析法（Colloidal gold immunochromatography assay, GICA）[15，16]等。PVDF 膜具有较强的疏水性和静电吸附作用，它对蛋白质具有极强的吸附能力，机械性比硝酸纤维素膜好，室温下不受酸、碱等强氧化剂和卤素等腐蚀，紫外灯照射1年，其性能基本不变[17]，故选用 PVDF 膜作为载体。本研究建立了基于 PVDF 膜基质的直接竞争免疫分析方法，可同时检测玉米中的 FB1 和 DON。样品前处理简单，检测时间 15 min，具有稳定性好、结果准确易于判定、经济实用等优点，适合于大批量样品的现场快速检测。2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Mill-Q超纯水仪、PVDF膜（3.75 m×26.5 cm, 0.45 　　?SymbolmA@ m）、超滤管（10 kDa, 美国Millipore公司）；SORVALL Blofuge stratos台式高速冷冻离心机（德国Heraeus 公司）；WD-9405 B水平摇床（北京沃德生物医学仪器公司）；单管可调微量移液器（0.5～10 　　?SymbolmA@ L, 德国Eppendorf公司）； DON-cBSA 全抗原、FB1-OVA 全抗原（本实验室自制）；抗 DON 单克隆抗体、抗FB1单克隆抗体（本实验室自制）；羊抗鼠IgG-HRP酶标二抗、OTA、AFB1、DON、FB1、FB?2、玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）、T-2毒素（T-2）、HT-2毒素（HT-2）标准品（美国Sigma公司）；辣根过氧化物酶（上海生工）；脱脂牛奶（加拿大Bio Basic Inc.公司）；单组分 TMB 显色液（沉淀型，湖州英创生物科技有限公司）；其它试剂均为分析纯以上。 　　2.2 抗体的纯化和酶标抗体的制备 　　采用辛酸-硫酸铵法[19]纯化抗 FB1 及抗 DON 单克隆抗体腹水，并用紫外及 SDS电泳测定纯化后抗体的浓度和纯度。 　　采用三聚氰氯法和高碘酸钠法分别制备抗 FB1和抗 DON 酶标抗体[19，20]。超滤浓缩除盐后，紫外分光光度计扫描，直接竞争 ELISA 方法确定酶标抗体的效价及特异性。 　　2.3 PVDF 膜基质免疫检测装置的制备 　　2.3.1 PVDF膜处理 用铅笔在PVDF膜上画出 5 个矩形（20 mm×9 mm），作为膜反