萝卜抗黑腐病黑斑病与根肿病育种相关基础研究.docVIP

萝卜抗黑腐病黑斑病与根肿病育种相关基础研究 　　摘 要：利用萝卜黑腐病菌株在42份萝卜种质资源苗期喷雾接种筛选获得6 份抗病材料，18 份中抗材料;萝卜块离体接种黑腐病菌株从13份高代自交系中筛选获得2 份中抗材料。利用萝卜黑斑病孢子悬浮液喷雾接种于离体叶片，从13份高代自交系中筛选获得1份抗病材料，6份中抗材料。利用已知的根肿病4号生理小种从13份高代自交系中筛选获得2份感病备选材料，4份抗病备选材料。 　　关键词：萝卜;黑腐病;黑斑病;根肿病 　　 “十二五”期间湖北省农科院经作所在萝卜抗黑腐病、黑斑病和根肿病育种上开展了相关基础研究，为后续抗性资源的利用、抗性遗传规律的研究以及分子标记的开发进行了技术储备。 　　1 萝卜黑腐病抗病育种相关基础研究 　　1.1 萝卜主产区病原菌的分离鉴定 　　 ①柯赫氏法则回接验证 采集萝卜主产区黑腐病病样，采用稀释涂布分离法在NYGA平板培养基上分离培养病原菌。采用苗期活体喷雾接种和萝卜块离体涂抹接种2种方法回接病菌，叶片出现了水渍状“V”字形斑与田间症状相似，萝卜块出现黑腐症状，说明采集的菌株均为黑腐病病原菌，然后从中选择致病力强的菌株进行后续试验。 　　 ②16S rDNA序列分析与Biolog细菌自动鉴定系统测定 将测得的WHHF菌株的16S rDNA序列与GenBank中的核酸数据进行比对，选取同源性较高的序列。WHHF菌株16S rDNA序列与油菜黄单胞杆菌油菜致病变种Xanthomonas campestris pv. campestris （Pammel） Dowson同源性极高，达到了99%，进一步明确了WHHF菌株属于油菜黄单胞杆菌油菜致病变种。 　　 应用Biolog细菌自动鉴定系统测定菌株，将结果经计算机处理后与数据库内已知的细菌比较，分析后进一步确认验证该菌株为油菜黄单胞杆菌[1]（Xanthomonas campestris pv. campestris）。 　　1.2 抗性种质筛选 　　 萝卜黑腐病多从叶缘水孔或伤口侵入[2]，基于侵染发病条件设计可分为活体接种或离体接种。活体喷雾接种适于多份种质资源需要快速检测其苗期抗病，重复多、接种量大时采用;离体菌液注射接种适于少量试验材料且发病条件易于控制时采用，可为喷雾接种初筛材料后的补充，采用该接种方法要求发病条件更??均匀一致。 　　 ①苗期喷雾接种 基于萝卜黑腐病侵染为叶缘水孔侵入，采用苗期喷雾接种法，即在光照培养室内（25～30℃），选择浓度为 1.0×108 cfu/mL的细菌悬浮液采用喷雾法于萝卜 5～6 片叶期接种，保湿 24 h，7 d 后调查病情，评价萝卜品种对黑腐病的抗性[3]。 　　 喷雾法分级标准：0 级：无病;0.1 级：叶上有一个小斑;0.5 级：叶上有几个病斑，或一个较大的病斑;1级：叶上发病区占叶面积的 1/4;2 级：叶上发病区占叶面积的 1/2;3 级： 叶上发病区占叶面积的 3/4;4级：病区占叶面积 3/4 以上至全叶。 　　 按病情分级调查后，计算病情指数，根据发病程度对抗病性分级。免疫（I）：病情指数=0;高抗 （HR）：040。 　　 利用该鉴定方法， 对萝卜 42 份种质资源进行了抗病性鉴定和分级，其中，有 6 份材料表现为抗病，18 份表现为抗性中等，其余 18 份均表现为不抗病。 　　 ②萝卜块离体接种 基于萝卜黑腐病侵染可从伤口侵入，且萝卜为根菜类作物，采用萝卜块离体接种方法，即在萝卜块中间用移液枪加上1×108 cfu/mL菌液，盖玻片将菌液均匀涂满萝卜块，接种后48 h调查病情指数。 　　 病情指数分级标准：0级：无症状;1级：在萝卜块上有水渍变黄症状;3级：病斑变成黄褐色并伴随腐烂症状;5级：病斑腐烂面积扩大并深入萝卜块中;7级：病斑变成黑褐色;9级：萝卜块完全黑腐萎蔫。 　　 按病情分级调查后，计算病情指数，根据发病程度对抗病性分级[1]。免疫（I）：病情指数=0;高抗 （HR）：040。 　　 由表1可见，13份高代自交系没有抗病材料，中抗材料有2份，其他均为感病和高感材料。 　　2 萝卜黑斑病抗病育种相关基础研究 　　2.1 萝卜主产区病原菌的分离鉴定 　　 采集萝卜主产区黑斑病病样，分离病健交接部位在PDA平板培养基上培养，显微镜下挑取单孢进行分离培养。对比参照十字花科链格孢形态确定致病菌为萝卜链格孢，采用苗期活体喷雾接种和萝卜叶片离体菌饼接种2种方法回接病菌，活体叶片出现了轮纹状黑斑与田间症状相似，萝卜块出现侵染症状[4]，说明采集的菌株均为黑斑病病原菌，然后选择致病力强且产孢量多的菌株WHHB1进行后续试验。 　　2.2 黑斑病病原菌发病条件确定研究