液相色谱―电感耦合等离子质谱与电喷雾电离质谱研究乙二胺二氯合钯与鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸反应产物.docVIP

液相色谱―电感耦合等离子质谱与电喷雾电离质谱研究乙二胺二氯合钯与鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸反应产物 　　摘 要 建立了基于HPLC-ICP-MS分离乙二胺二氯合钯与鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸5′-dGMP反应产物的方法。方法得到两种能够随色谱流出的产物，产物在25 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 8.0）作为流动相时，得到的分离峰型良好。主产物保留时间为2.8 min，另一产物保留时间为3.2 min。主产物经富集后由ESI-MS（MS/MS）鉴定得到m/z 为 510，511，512，514和516的 +分子离子峰且丰度比与Pd同位素元素一致，再通过碎片推断结构为，另一种产物经HPLC-DAD解析发现紫外吸收光谱与完全相同，HPLC-ICP-MS发现产物含Pd量也与相同，结合文献推断另一产物为的多聚物。研究表明，易在酸性条件下生成，其多聚物易在碱性条件下生成，在反应体系pH=6.0时，在12 h内生成且稳定存在。HPLC-ICP-MS图谱显示随着反应pH的增加两种产物的总量逐步减少。 　　关键词 电感耦合等离子体质谱； 液相色谱； 鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸； 钯化合物 　　1 引 言 　　与Pt配合物相同，Pd配合物也有杀伤肿瘤细胞作用，Pt和Pd性质相近，采用dsp2杂化形成平面四边形配合物，具有高度相似的结构特征。Pt配合物杀伤肿瘤细胞的机理是：其与DNA中的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸5′-dGMP形成分子键，使核酸变性细胞死亡；同样，Pd配合物也能使核酸变性的细胞死亡。 　　核酸由单核苷酸组成，而5′-dGMP和5′-GMP（鸟嘌呤核糖核苷酸）是核酸的重要组成，研究Pd与5′-dGMP和5′-GMP发生分子键合原理和方式对Pd损伤DNA以及细胞凋亡机理有理论和现实意义，对开发Pd抗癌药物有指导作用。Zhu等用电位滴定法和H1NMR研究了乙二胺二水合Pd2+与鸟嘌呤核苷酸5′-GMP相互作用，认为在pH 5.0时2+与5′-GMP的N1位氮形成化合物；在pH8.0时，4分子5′-GMP上N1和N7位氮会与4分子2+形成四元环状化合物4。Zhang等通过计算确定了2+与鸟嘌呤形成的四元环状化合物结构。Wirth等研究了2+与5′-GMP相互作用，认为溶液中除了形成化合物单体和环状四聚体外还有二聚体。文献均在混合体系中研究产物组成而未对其进行分离检测具有一定局限性，且文献所采用的滴定分析法不能直观定性，产物具有潜在不确定性。色谱和质谱是对复杂体系分离和定性的有力工具，近年来，基于HPLC-ICP-MS研究食品保健品、水质、生物样本中元素的形态得到巨大的发展，在铂类抗癌药物的研究中得到广泛应用，但未见用于Pd类抗癌药物的研究。 　　本研究采用HPLC-ICP-MS联用分离（结构式见图1b）与5′-dGMP（结构式见图1a）反应产物，HPLC-DAD对产物初步定性，并用ESI-MS得出主产物分子结构。研究发现，与5′-dGMP反应产物中有两种能够在给定色谱条件下流出，且具有相同的紫外吸收光谱，其中主产物经ESI-MS（MS/MS）定性为，而另一种产物为它的多聚物，其中可大量存在于碱性体系中。研究还发现，在反应体系pH 6.0时，与5′-dGMP反应在12 h内完成。本研究建立的基于HPLC-ICP-MS分离乙二胺二氯合Pd与5′-dGMP反应产物的方法未见报道，本方法经改进，可用于其它Pd抗癌药物的形态分析。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　ESI-MS为TSQ QUANTUM ACCESS MAX串联质谱仪、X-7电感耦合等离子体质谱及其工作站（美国，Thermal公司）；色谱与ICP-MS用Peek管相连，电子触发采集数据；OriginPro 7.0绘图软件；LC-20AB液相色谱仪（日本岛津公司），配备二极管阵列检测器（DAD），色谱柱为Acclaim PA2 C18柱（250 mm×4.6 μm，美国戴安公司）。 　　99%乙二胺二氯合Pd和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸二钠盐（美国Sigma-Aldrich公司）；Na2HPO4、KH2PO4、HCl、NaOH（分析纯，南京化学试剂二厂）；娃哈哈纯净水（电阻率大于18 MΩ cm），1000 mg/L Lu和Pd单标溶液（美国Spex公司）；HNO3（德国默克公司）。 　　2.2 与5′-dGMP反应条件 　　分别称取4.7 mg（0.02 mmol） 和7.8 mg 5′-dGMP二钠盐（0.021 mmol），混合，用水溶解并定容至10 mL，其中5′-dGMP略过量，用磷酸盐缓冲液和NaOH分别调节至pH 6.0， 8.0， 9.0和10.0，在37 ℃水浴中恒温反应48 h，得到产物的浓溶液，色谱进样前适当稀释。 　　2.3 ICP-MS和ESI-MS