Q5B 对用于生产rDNA来源蛋白质产品的细胞的表达构建题分析.pdfVIP

Q5b 人用药品注册技术要求 国际协调会 ICH三方协调指导原则 对用于生产rDNA来源蛋白质产品 的细胞的表达构建体分析 1995年11月30日由ICH指导委员会推荐 （ICH进程第4阶段） 本指导原则按ICH进程由相应的ICH专家组制定并经各药品 管理部门协商进入第四阶段，推荐给欧盟、日本和美国的管理 机构。 对用于生产rDNA来源蛋白质产品的 细胞的表达构建体分析 I 引言 本文件旨在为用真核和原核细胞生产重组DNA蛋白产品的 表达构建体的鉴定提供指导,内容仅限于有助于评估重组DNA蛋 白表达构建载体时的相关信息,不涵盖rDNA来源的医药产品的 所有有关质量的内容。 表达构建体的定义为含有重组蛋白编码序列的表达载体。 为保证终产品的质量和一致性,应使用核酸技术并结合其他用 于纯化重组蛋白的方法分析表达构建体片段。鉴于这个试验仅 仅是评价重组基因的编码序列,而不包括翻译的忠实性以及重 组蛋白的其他特征如二级结构、三级结构和翻译后修饰,对表达 构建体在核酸水平上的分析只能视为整体质量评价的一部分。 Ⅱ表达构建体分析的基本原理 表达构建体分析的目的是确保产品的正确编码序列被导入 到宿主细胞,并从培养到生产结束保持不变。在活细胞中产生的 重组蛋白,其基因序列可能发生突变而改变蛋白质的性质,从而 对病人产生潜在的副作用。应该说没有一种单独的试验方法能 检测蛋白质所有可能发生的修饰,蛋白质分析技术是用于估测 蛋白质的氨基酸顺序和由于翻译后修饰如蛋白水解、糖基化、 磷酸化；乙酰化等作用形成的表达蛋白质的结构特征。因为蛋 白质分析方法有时不能检测到所有重组蛋白编码序列突变造成 的蛋白质结构变化,所以从核酸分析中得到的资料亦是有用的。 对于不同的产品,核酸分析和蛋白分析的相对重要性是不一样 的。 核酸分析可用于验证表达构建体的编码序列和物理状态。 核酸分析的目的不是为了检测少量变异序列,而是为了能确保 被表达的蛋白有正确的氨基酸顺序。当生产细胞有多个整合的 表达构建体拷贝时,并非所有的拷贝都具有转录活性,因此通过 对mRNA或cDNA的分析测定转录产物本身,也许比对基因组DNA的 分析更合适。测定成批核酸的分析方法,如对混合克隆或聚合酶 链反应扩增产物进行测定,也许可替代依靠选择单一DNA克隆的 方法。也可考虑其他能快速、灵敏地确证表达构建体中重组蛋 白的编码序列的方法。 以下介绍在生产体系开发和确认期间,对于表达构建体的 鉴定应提供的资料。为确认序列的目的所使用的各种分析方法, 应予以验证,验证文件至少应包括对各变异序列的检测限度的 估测。对核酸或蛋白测序方法都应作这样的评价。要运用在科 技情报方面的新进展,并对先进的新技术和科技信息加以应用。 Ⅲ 表达系统的鉴定 A 用以制备主细胞库(MCB)的表达构建体和细胞克隆 生产者应说明蛋白质的核酸编码序列的来源,包括最初从 中获得核酸序列的细胞的鉴别和来源,及用于制备蛋白质DNA编 码序列的方法。 应详细说明表达构建体构建的步骤,不论蛋白质是否是作 为融合蛋白合成的,都应说明表达构建体组成成分,如复制起 点、抗生素耐药基因、启动子、增强子的来源和功能。应提供 质粒的详细组成图并完整标明其顺序,指出哪些区域是在质粒 构建时测序的,哪些是从文献得来的。对质粒编码的其他表达蛋 白也应予以说明。从插入载体的目的基因编码区和相关的侧翼 区的核苷酸顺序,至插入的接头顺序,都应进行DNA序列测定。 应提供表达构建体转移到宿主细胞的方法,还应详细说明 用于扩增表达构建体的方法和用于选择生产细胞克隆的标准。 B 细胞库系统 重组蛋白的生产应建立在已经过检定研究并确定的主细胞 库和工作细胞库基础上。细胞库是装有均一细胞成分并在规定 条件下储存的安瓿集合,每个安瓿含有等份的单批细胞。主细胞 库通常来自选定的含有表达构建体的细胞克隆。工作细胞库 (WCB)是通过扩增一个或多个MCB的安瓿制得。应详尽表述细胞 系的历史和细胞库的生产过程,包括培养和体外细胞传