辛伐他汀对心衰心肌细胞肌浆网钙泵影响.pptVIP

辛伐他汀对心衰心肌细胞肌浆网钙泵的影响 苏州大学附属第一医院：曲辅政 指导教师：刘志华教授 一．研究背景 慢性心力衰竭是临床常见病、多发病，因致死率、致残率高，一直是临床研究重点。当今国内外对慢性心力衰竭病理生理的研究更多集中于兴奋收缩的钙循环环节。钙循环过程主要包括肌浆网（SR）钙释放、钙回摄、钙储存三个过程。 正常情况下，心肌舒张期SERCA2a（肌浆网钙泵）将大部分钙离子回摄到肌浆网储存， SERCA2a的调节包括直接调节和间接调节。 CaMKⅡ（钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ)发挥直接调节作用，PLB（受磷蛋白）发挥间接调节作用；PLB去磷酸化时与SERCA2a结合，抑制了SERCA2a对钙离子的亲和力，而PLB磷酸化后与SERCA2a解离，SERCA2a对钙离子的亲和力增加,对钙离子的回摄能力提高。PLB有3个磷酸化位点，即丝氨酸-16、苏氨酸-17、丝氨酸-10位点；但主要发挥作用的是丝氨酸-16位点。丝氨酸-16位点由PKA(蛋白激酶A)磷酸化、 PP1α（磷酸酶1α）去磷酸化。 心衰时心肌细胞SERCA2a表达及活性有无变化，其变化的机制是什么?他汀类药物用于慢性心力衰竭治疗，可改善心功能，减轻心力衰竭症状。对肌浆网钙泵有何影响?目前国内外文章鲜见报道。  通过观察辛伐他汀对心衰心肌细胞PLB、SERCA2a、CaMKⅡ、PKA、PP1α的表达以及SERCA2a功能、PKA、CaMKⅡ活性的影响，探讨心力衰竭的分子生物学机制以及辛伐他汀改善心力衰竭的分子生物学机制。 三．研究方法 2.4 γ-32P底物掺入法测定CaMKⅡ、PKA的活性:  ①提取细胞浆蛋白； ②用BCA法测定蛋白浓度； ③按CaMKⅡ、PKA检测试剂盒说明测定二者的活性。 2.5 无机磷酸根法测定SERCA2a活性:  ①制备肌浆网； ②用BCA法测定蛋白浓度； ③按试剂盒说明测定SERCA2a的活性。 2.6 利用光谱荧光检测技术测定肌浆网的摄钙能力:  ①制备肌浆网； ②用BCA法测定蛋白浓度； ③测定肌浆网的摄钙能力。 计算公式  [Ca2+]=Kd×（Rt﹣Rmin）/（Rmax﹣Rt）×Sf2/Sb2 家兔7周后PP1α蛋白的表达比较 图1-11 图1-12 * * 二．研究目的 1 研究对象： 18只家兔，雌雄不拘，分为3组： 假手术组6只，心力衰竭组 6只，辛伐他汀干预组 6只(术后即予辛伐他汀10mg/kg/d，至实验结束)。 2.实验方法： 2.1：心衰模型的建立（主动脉瓣损伤+腹主动脉缩窄法）： ①用戊巴比妥麻醉家兔，从右侧颈总动脉用4F导管破坏主动脉瓣。 ②2周后，进行腹主动脉缩窄。用戊巴比妥麻醉，打开腹腔，在肾动脉上方，将腹主动脉缩窄50%左右。 ③观察指标：包括呼吸、活动、进食、紫绀情况。 药物对左室重构的影响 ①心脏超声观察心脏变化，观察指标：左房内径、左室舒张末径、左室收缩末径、室间隔厚度、左室后壁厚度、射血分数、左室缩短率。 ②解剖学观察药物对心室重构的影响：观察心脏重量、左心室重量、心脏重量指数、左室重量指数。 ③血液动力学观察：观察左室舒张末压、左室收缩末压。 2.2 RT-PCR检测心肌组织PLB、SERCA2a mRNA表达: ①抽提mRNA ②逆转录 ③扩增 SERCA2a 正义引物：F-TGAATAAACCGCCTCGG； 反义引物：R-CAGCACCATCAGCCACT； PLB 正义引物：F-ACTTCCCAGCTACAAGCCCA； 反义引物：R-CTGATGTGGGAAATGACGGA； β-actin 正义引物：F-CTTCTCCTTGATGTCCCGCACGAT ； 反义引物：R-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG ； 扩增条件为94℃预变性4min，然后进入PCR循环,94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次再延伸7min。SERCA2a、PLB与β-actin扩增片段长度分别为464、368、231bp。 ④电泳 ⑤图像分析 2.3 Western blot检测心肌细胞膜SERCA2a、细胞浆CaMKⅡ、PKA、PP1α蛋白表达: ①提取心肌细胞膜、细胞浆蛋白； ②用BCA法测定蛋白浓度； ③Western blot分别检测心肌细胞膜SERCA2a蛋白、细胞浆CaM、CaMKⅡ、PKA、PP1α蛋白表达。 3 统计分析 各组测得