植物分子生物学-第一章 植物基因的同源克隆课件.ppt

植物基因的同源克隆 陈桂信 福建农林大学园艺学院;植物基因同源克隆的原理;;植物基因同源克隆的策略;2. 植物总RNA的提取与纯化 逆转录 cDNA 保守区引物设计 PCR扩增 构建cDNA文库 保守区cDNA片段 设计RACE引物 5/-RACE 3/-RACE cDNA文库筛选 基因的cDNA全长 ;植物DNA的提取方法; 植物DNA提取的必经步骤;1.破碎细胞壁:液氮研磨。 2.裂解细胞：CTAB（Cetyl Trimethyl Ammonium Bromige，十六烷基三甲基溴化铵)或SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，十二烷基磺酸钠）—裂解膜结构，EDTA—螯合核酸酶中的Mg2+，65℃保温30-60min —钝化内源核酸酶。 3.去除多酚类、多糖等次生物质。 4.去除蛋白质：用酚、酚与氯仿（1:1）、氯仿与异戊醇（24:1）抽提；5MKAc（pH7.5)沉淀蛋白质；蛋白酶K水解蛋白质。 5.沉淀核酸：0.6-1.0倍体积冰冷的异丙醇；2倍体积的无水乙醇；70%乙醇—清洗沉淀中的无机离子。 6.除RNA：用RNase消化；用LiCl沉淀RNA。 7.浓缩DNA：0.1倍体积3MNaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙醇沉淀。 8.溶解DNA沉淀：0.1或1×TE(pH8.0）或无菌双蒸水。;植物DNA提取的难点;多酚、多糖与其它次生物质的去除;1.材料的选择与处理：新鲜、幼嫩—嫩芽、嫩叶、幼苗；叶片的饥饿处理：4℃黑暗处理1-2天，消耗淀粉和多糖。在研磨后用-20℃预冷的丙酮抽提2次。 2.在细胞裂解之前分离细胞核（两步法）除多糖和多酚：研磨：破坏细胞壁，释放果胶类多糖细胞器与核膜保持完整 加入核分离缓冲液（不含去垢剂）混匀 低速离心去上清（多糖、酚类） 加入含去垢剂的核裂解液。 3.调整提取缓冲液的组成除多糖和多酚：NaCl：浓度为0.7M时，RNA与DNA溶于CTAB，而多糖不溶解，CTAB与多糖和残留的蛋白质形成复合物，通过氯仿或酚抽提停留在界面上，容易去除；浓度为0.4M时，核酸沉淀。CTAB：常用2.0%，多糖含量高的可提高至3.0%。pH值：通常为8.0，低pH（5.5）能避免酚类物质的电离和随后的氧化。 ;4.在提取缓冲液中加入抗氧化剂除多酚：β-巯基乙醇、抗坏血酸纳、半胱氨酸、二硫苏糖醇等—提供巯基（-SH），与酚类物质竞争氧，防止酚氧化成醌，β-巯基乙醇：常用0.1-2.0%，酚类高的可用至5.0%。有的在提取缓冲液中加入PPO的抑制剂如0.1%(W/V)DIECA—diethyldithiocarbamic acid。 5.研磨时加入大分子聚合物或吸附剂除多酚：PVP、PVPP：2-6.0%（W/V）；活性炭：0.1-0.3%（W/V）。 ;6.高盐