5.1-生物DNA的粗提取与鉴定.ppt

注意： 色谱柱不能内不能有气泡； 装完后，立即用缓冲液洗涤，平衡凝 胶是凝胶装填紧密 血液组成成分 阅读思考： 血液由______和________两部分组成。 血细胞中________细胞数量最多，细胞中含量最高的化合物是_____________。 血红蛋白是由 ___________和____________构成的（4条肽链），每条肽链环绕一个能与O2和CO2结合的______________基团。 血浆 血细胞 红细胞 血红蛋白 2条α-肽链 2条β-肽链 亚铁血红素 1. 红细胞洗涤 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 红细胞 5倍体积生理盐水 搅拌10min 重复洗涤3次，直至上清液没有黄色 目的：洗去血浆蛋白 滤纸 过滤 脂类物质 3.分离血红蛋白 红细胞 混合液 高速离心 10min 离心管 烧杯 有机溶剂 血红蛋白 2.释放血红蛋白 操作目的分析： 蒸馏水的作用是________________________。 加入甲苯的作用是______________________。 充分搅拌的目的是______________________。 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 20mmol/L磷酸缓冲液 4.透析血红蛋白 透析的目的： 1mL 1mL 1mL 去除血红蛋白中的小分子杂质 纯化－－凝胶色谱法洗脱 1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 图5－19示制作橡皮塞 3.样品的加入和洗脱 纯化－－凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 教材图5－19 3.样品的加入和洗脱 纯度鉴定：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 * §5.1 DNA的粗提取与鉴定 一、基础知识 （一）提取DNA的方法 1.提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 2.提取DNA的基本思路 提取DNA，去除其他成分 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异 ⑴ DNA的溶解性 DNA和蛋白质等成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀；或者让其他成分溶解，DNA析出。 3.DNA等大分子的理化性质 ⑵ DNA不溶于酒精溶液 DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。 ⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ① 蛋白酶——水解蛋白质，对DNA没有影响 ② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃ 而DNA在80℃以上才会变性 ③ 洗涤剂——溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质 但对DNA没有影响 （二）DNA的鉴定 沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色。 二、实验设计 （一）实验材料的选取 从下列材料中选取2～3种 原则： 菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜； 鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞； 在液体培养基中培养的大肠杆菌 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑 选用DNA含量相对较高的组织 要容易取得、细胞分散或容易分散、细胞容易破碎或容易研碎、细胞核中的DNA容易释放。 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞 ——容易破碎 鸡血细胞溶液： 加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液。 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂； 加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出DNA。 2、植物细胞 ——需要溶解细胞膜 ① 加入一定的洗涤剂和食盐 ② 充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 洗涤剂——离子去污剂，能溶解细胞膜，利于DNA释放 食 盐——NaCl，利于DNA溶解于研磨液中。 研磨不充分，核内的DNA释放不完全，提取的DNA量少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理。 讨论：滤液/研磨液中可能含有哪些成分？ 可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质 1. DNA的溶解性 2. DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 （三）除去滤液中的杂质 利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白质分开； 利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性与DNA分离。 为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？ （四） DNA的析出与鉴定 与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95％)， 静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物。 ——粗提取DNA 1、DNA的析出 用玻璃棒沿一个