092406136吕慧-低氧模拟剂氯化钴对胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达的影响课件.pptVIP

参考文献;实验原理 实验材料 研究方法 研究结果 ;实验原理;实验材料;实验方法; 扩增片段长度为480 bp, 复性温度为58℃。循环条件: 95℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 58℃复性30 s, 72℃延伸30 s, 30个循环, 72℃延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳, LabWORKS凝胶图像分析系统分析扩增产物条带的光密度值, 并通过S100A4光密度值与b-actin光密度值的比值反映S100A4 mRNA表达量的高低。 ;3 Western blotting检测BGC823细胞中S100A4蛋白表达 收集实验组和对照组细胞, 立即置于冰上,吸净培养基并以4℃预冷的PBS 漂洗细胞1~2次, 提取细胞总蛋白, 以Bradford 法作蛋白定量后, 取 50 mg 蛋白作SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(5%积层胶, 10%分离胶),电转膜后, 加入兔抗人S100A4 多克隆抗体( 1︰1000 )和羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体, b-actin作为内参照,利用ECL显色试剂盒显色, 应用图象分析仪测定条带光密度值, 以S100A4光密度值与b-actin光密度值的比值来反映S100A4蛋白表达的高低。 ;4 免疫细胞化学及免疫荧光检测S100A4蛋白在BGC823细胞中的表达 将BGC823细胞接种于玻片上, 200 mmol/L氯化钴处理24 h后, 取出玻片, 4%甲醛固定。一抗为兔抗人S100A4多克隆抗体(1︰1000稀释), 4℃孵育过夜。免疫组化采用北京中杉金桥生物技术有限公司SP检测试剂盒进行, DAB显色, 光学显微镜下观察结果; 免疫荧光二抗为FITC标记的鼠抗兔IgG(1︰2000稀释), 室温孵育2 h后荧光显微镜下观察结果。;.5 统计学分析 采用SPSS统计软件进行t检验, P0.05具有统 计学意义。;结果与分析 ;图 1 不同浓度CoCl2 处理后BGC823 细胞中S100A4 mRNA 的表达情况 1: DL2000 分子量标志; 2: 对照组BGC823 细胞; 3: 100 μmol/L CoCl2; 4: 200 μmol/L CoCl2; 5: 500 μmol/L CoCl2。 Fig. 1 Expression of S100A4 mRNA in BGC823;2 氯化钴对BGC823细胞S100A4蛋白表达的 影响 Western blotting结果显示, 200 mmol/L CoCl2处理24 h后, S100A4蛋白表达明显增高(图 2), 实验组S100A4蛋白表达(1.6633±0.3496)显著高于对照组(0.7300±0.1868)(P 0.05)。 ?;图 2 Western blotting 检测 BGC823 细胞中S100A4 蛋 白表达 1: 对照组; 2: 200 μmol/L CoCl2 处理24 h。;3 免疫组化和免疫荧光检测S100A4在BGC823细胞中的表达 免疫组化(图3)及免疫荧光(图4)结果显示, 氯化钴处理后S100A4蛋白表达明显???于对照组。;图 3 免疫组化检测BGC823 细胞中S100A4 蛋白的表达 A: 对照组; B: 200 μmol/L CoCl2 处理24 h。;图 4 免疫荧光检测BGC823 细胞中S100A4 蛋白的表达 A: 对照组; B: 200 μmol/L CoCl2 处理24 h。;讨论;另外, 以往的研究发现S100A4在乳腺癌、结直肠癌、食管鳞癌、骨肉瘤、前列腺癌等肿瘤中均呈高表达, 且与肿瘤侵袭、转移和患者的预后不良有关。而这些肿瘤作为实体瘤也存在低氧微环境, 因此我们在胃癌中的研究结果可能对这些肿瘤侵袭转移的分子机制研究也具有借鉴意义。;总之, 本研究首次证明低氧模拟剂氯化钴处理可以使胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达增高, 该结果加深了低氧对胃癌侵袭转移影响分子机制的认识, 同时也发现了S100A4 基因表达调控的新途径-微环境低氧。该结果为胃癌侵袭转移的防治研究提供了重要科学依据, 也为其他肿瘤的研究提供了新思路。