福建医科大学博士学位课题.ppt

5. 采用Ni-NTA 树脂分离融合蛋白 将上述方法确认的阳性菌接种，诱导表达，确定表达后目标蛋白的部位。收集蛋白，按树脂使用说明书将样品加到Ni层析柱中，流速控制在0.5ml/min左右，不断增加咪唑的浓度，收集穿透部分，超滤离心，SDS/PAGE分析。 6.化学法蛋白融合蛋白，分离IGF-1 将树脂分离的融合蛋白超滤离心，除去各种小分子。将蛋白置下列反应体系中：蛋白5mg/ml, 羟胺2M, Tris 0.2M, pH 9.0(NaOH调), 45反应4小时。然后HCl调pH 8.0, 降温，终止反应。采用Ni-NTA 树脂,M-Sepharose蛋白层析柱分离裂解蛋白。 纯化的IGF-1的鉴定 将分离的IGF-1在透析袋中透析，除去各种小分子。透析后的透析液冷冻干燥后将蛋白复溶。 采用ELISA（同上）对纯化后蛋白的免疫源性进行再次鉴定。此外，测定纯化蛋白的N端序列，等电点。采用MALDITOF法（Matrix-Assisted Laser Desorption Time-of-Flight ）测定蛋白的分子量。 蛋白活性检测 参考文献，将成纤维细胞NIH3T3用含有10％ 小牛血清的DMEM 常规培养，将IGF-1以0.2、1、5ug/ml的终浓度加入到细胞培养液中，MTT法检测IGF-1对细胞增殖的影响。 * * 福建医科