抗肿瘤药物研究及新药筛选的研究方法课件.ppt

2.药物对细胞倍增时间（TD）的影响 细胞倍增时间是指细胞数增加1倍所需的培养时间。以t代表培养时间，No和Nt分别代表接种细胞后和培养t小时后的细胞数。按下述细胞倍增时间计算公式计算倍增时间，如倍增时间延长表明药物抑制了细胞增殖，即增殖能力减弱。 0.301 t TD＝ lgNt－lgNo 第七节 肿瘤侵袭与转移的研究方法 肿瘤细胞具有多种生物学特性，其中侵袭和转移是最重要的特性之一，也是恶性肿瘤的重要标志。肿瘤侵袭(invasion)是指恶性肿瘤细胞突破基膜和细胞外基质(ECM)构成的组织学屏障，侵犯到邻近的正常组织，并在该处继续繁殖生长的过程。侵袭是贯穿肿瘤转移全过程的重要步骤，瘤细胞穿入、穿出血管或淋巴管和侵入靶器官都是侵袭行为的具体表现。 肿瘤侵袭是一系列多步骤的复杂过程，可分为四个步骤： ①肿瘤细胞彼此间的粘附力减低，使细胞彼此分散； ②肿瘤细胞通过细胞膜表面粘附分子受体与基膜、ECM成分的层粘蛋白、纤连蛋白及胶原蛋白等结合； 细胞间粘附力减低 粘附分子受体与ECM成分结合 ③肿瘤细胞分泌和活化蛋白水解酶前体，蛋白水解酶降解由细胞间基质和基膜组成的ECM，主要是降解构成基膜的主要成分Ⅳ型胶原； ④肿瘤细胞穿过破损的基膜和基质，借助于自身的阿米巴运动而游出，迁移到其周围，发生侵袭性生长。 上述步骤反复进行，肿瘤逐渐向深层及周围侵袭。 蛋白酶降解ECM 肿瘤细胞穿过破损基膜和基质 肿瘤转移(metastasis)即恶性肿瘤细胞借助血道、淋巴道等途径，在远离肿瘤原发生长部位形成继发瘤的过程。 肿瘤转移始于恶性侵袭，转移是连续多步骤的过程，主要有： ①原发瘤增殖，肿瘤新血管生成； ②肿瘤细胞侵袭毗邻的基膜、基质和正常细胞； ③瘤细胞穿入血管或淋巴管并在循环系统中存活； ④瘤细胞栓塞、滞留于远处靶器官的微血管中并增殖； ⑤瘤细胞穿出血管，在靶器官内形成微转移灶； ⑥肿瘤间质内新血管生成，转移瘤快速生长。 可见，在转移过程中肿瘤细胞需穿过三个基膜屏障而形成转移灶。 恶性肿瘤侵袭与血行转移 侵袭和转移是肿瘤恶性行为的最本质特征。侵袭和转移的关系密切，高侵袭性肿瘤通常具有高转移能力。就大多数恶性肿瘤而言，侵袭和转移是一个过程的两个阶段，即侵袭是转移的前奏和基础，转移是侵袭的结果。 侵袭和转移是恶性肿瘤威胁人类健康与生命的主要原因，防治肿瘤的侵袭、转移是降低肿瘤死亡率的重要途径之一。 一、肿瘤侵袭的常用体内模型 (一)小鼠子宫颈癌U14肾侵袭模型 现多以昆明小鼠为宿主。小鼠子宫颈癌U14为实体型，具有血液和淋巴系统双重转移特点，淋巴转移率＞90%，并可发生肺转移，但自发转移率不高。 [造模原理] 肾包膜是缺乏免疫监视的部位，局部血供丰富。将U14瘤块接种于近交系615小鼠的肾包膜下，肿瘤生长并向肾实质内侵袭。 对荷瘤肾脏进行组织病理学观察，并用半定量分级方法判断肿瘤侵袭到肾实质的程度。该模型可用于癌细胞侵袭能力的检测和抗肿瘤侵袭药物的筛选。 [操作方法] 1.将U14瘤细胞接种于近交系615小鼠背部皮下，成瘤后，在无菌条件下剥离瘤块。 2.去除瘤块的坏死部分，剪成1mm直径的小块，PBS冲洗5次，置冰浴上备用。 3.用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉615小鼠。 4.将小鼠右侧背部皮肤消毒，在右侧脊肋角处切开皮肤长1cm，分离组织暴露右肾。用无钩镊子夹持右肾。用套管针或穿刺针吸取制备好的小瘤块，穿刺把瘤块移植于肾外侧中线处的包膜下。将肾复位，缝合切口。 5继续喂养10d后，颈椎脱臼法处死小鼠，取出右肾。 6.称小鼠体重、右肾重。 7.解剖显微镜下测量右肾内肿瘤的最长径(a)和最短径(b)。按公式计算肿瘤体积(V)，V＝ab2/2。 8.甲醛液固定右肾，制备组织切片后光学显微镜观察。 9.利用计算机图像分析系统可测量肿瘤的总面积、侵袭到肾实质的肿瘤面积及两者的比值。 10．肿瘤肾实质侵袭程度组织学分级参考标准,进行侵袭程度的半定量（判断标准略）。 [模型评价] 1.肾皮质区血管床丰富，可为瘤细胞的成活、生长和侵袭提供充足的血液供应。 2.肾包膜透明，且移植于肾包膜下的瘤组织局限于一定位置，便于测量其大小和形态学观察。 3.肾组织结构分明，层次清楚，容易与瘤组织相区别，便于侵袭过程的形态学观察。 [注意事项] 1. 无菌操作。 2.手术后小鼠必需保暖，直至苏醒，否