黑曲霉柠檬酸积累代谢机制研究进展.docVIP

黑曲霉柠檬酸积累代谢机制研究进展 　　摘要：柠檬酸是能量代谢的产物，只有在阻止正常代谢进行的情况下柠檬酸才可能大量积累。20世纪30年代人们已经初步掌握了黑曲霉（Aspergillus niger）柠檬酸的发酵条件并进行规模化生产，然而对柠檬酸积累机理的研究还不是很透彻，黑曲霉柠檬酸积累引起了众多研究者的关注。另外，一些新的生物技术如基因组学技术的应用也为黑曲霉柠檬酸代谢的深层研究提供了可能。综述了黑曲霉柠檬酸代谢过程中己糖的输送、糖酵解和能荷调节机制的研究进展。 　　关键词：黑曲霉（Aspergillus niger）；柠檬酸积累；代谢机制 　　中图分类号：TQ921+.1；TS261.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1489-04 　　柠檬酸（2-羟基-丙烷-1，2，3-三羧酸）最初被认为是柑橘属植物的一种组分，作为三羧酸循环（TCA）的中间产物被发现已经近70年。柠檬酸结合低毒、可口性和美味于一体，已成为一种广泛的食品添加剂。并且柠檬酸能够螯合铁、铜等重金属离子，因此在金属离子催化的氧化反应过程中，对油、脂肪和抗坏血酸的稳定性具有重要的作用，已被广泛应用于医药和化妆品行业中[1]。 　　目前，柠檬酸全世界消耗量已达120万t，年产量达160万t，市场贸易量为90万t以上，且每年以7%的速度递增。虽然柠檬酸有一小部分在酵母发酵中产生，但大多数发生在真菌黑曲霉（Aspergillus niger）中。数十年来，黑曲霉积累柠檬酸的生化代谢机制引起了基础科学和应用科学研究者的广泛关注，并开展了大量研究。本文结合近些年来黑曲霉合成柠檬酸代谢机制的研究进展，对其进行总结概括，以求更深入理解其内在机理。 　　1 黑曲霉合成柠檬酸的途径 　　自1940年TCA学说建立以来，柠檬酸的发酵机理逐渐被人们所认识。Cleland等[2]的研究表明柠檬酸的合成过程包括葡萄糖酵解的分解代谢。由于柠檬酸合成酶位于线粒体中，合成的草酰乙酸并不立即参与柠檬酸合成酶的反应，而是首先被细胞质中的苹果酸脱氢酶催化形成苹果酸，进而通过苹果酸-柠檬酸反向转运进线粒体（图1）。由图1可知，柠檬酸是整个TCA代谢过程中的中间产物。在柠檬酸积累过程中，只有当黑曲霉顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶活性很高时才有利于柠檬酸的大量积累。 　　2 黑曲霉合成柠檬酸的代谢调控 　　2.1 葡萄糖的吸收 　　对于柠檬酸发酵，由于黑曲霉在以葡萄糖和果糖为碳源时能够很好地生长，所以通常采用己糖为碳源。对于工业用蔗糖，一般采用在低pH条件下高温灭菌或者利用细胞外的转化酶水解为单糖。葡萄糖吸收主要依靠两种亲和性不同的运载体的被动扩散作用。Vankuyk等[3]发现了一个由mstA编码的高亲和性的运载体，碳源浓度较低时该高亲和性运载体就能够生成，它能够催化单糖/H+交换，其Km值为25±10 μmol/L，试验发现pH降低或者柠檬酸浓度升高会影响该运载体的活性。 　　葡萄糖达到15%（W/V）时，黑曲霉内除高亲和性运载体外，还生成一种低亲和性的运载体，该低亲和性运载体受pH和柠檬酸的影响比高亲和性运载体要小。低亲和性运载体的Km值为360 μmol/L，远比高亲和性运载体大。借助同源构巢曲霉的基因分析发现，低亲和力运载体可能有mstE基因编码，mstE基因的表达随葡萄糖浓度的升高而加强。 　　需要说明的是，这两种运载体提供的是促进扩散而非主动运输。促进扩散和主动运输均与底物葡萄糖浓度呈非线性关系，但是简单扩散却是线性关系。Wayman等[4]的试验发现葡萄糖的吸收率与葡萄糖浓度为简单的线性关系而不是非线性模式。即使底物中柠檬酸的浓度很高，且这种高浓度的柠檬酸对运载体有抑制作用，但葡萄糖吸收的速率却不受限制[5]。 　　2.2 糖酵解的调节 　　发酵初期磷酸戊糖途径占主要部分，黑曲霉生长期间几乎全部TCA酶的含量都很高，此时大量的葡萄糖被用于黑曲霉菌株的生长。24 h后开始有柠檬酸生成，如图1所示，在柠檬酸发酵初期，柠檬酸通过TCA循环转换为α-酮戊二酸。NAD-和NADP-专一性异柠檬酸脱氢酶此时具有很高的活性。可以看出，柠檬酸积累的最初阶段并没有阻断TCA循环。然而此时柠檬酸产量比理论值要高，这可能是氨基糖的瞬时积累及释放所致[6]。在柠檬酸积累的诱导期间，延胡索酸和异柠檬酸减少，丙酮酸、草酰乙酸和柠檬酸增加。这种中间产物水平的短暂变化主要是因为α-酮戊二酸脱氢酶的减少，进而导致琥珀酸、延胡索酸的水平降低。同时由于酶解作用强烈使丙酮酸和草酰乙酸增加，这为柠檬酸的积累提供了条件[7]。 　　糖酵解的调节可以在不同的层面上进行：转录水平调节；利用特定效应因子以及翻译后修饰调节别构酶活性[8，9]。对糖酵解调