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基因克隆和表达研究进展 　　摘要 基因的表达和调控是植物基因工程研究的中心内容之一，从基因克隆方法、克隆载体的构建、瞬时表达分析、报告基因的选择以及基因表达量分析的方法5个方面对植物基因克隆与表达的研究进展进行了综述。 　　关键词 基因表达；基因克隆；表达量分析；Northern杂交 　　中图分类号 S785文献标识码A文章编号1007-5739（2008）22-0280-02 　　 　　植物的生长发育和生命周期是不同的基因在时间和空间上有序表达的结果。基因的表达调控受多种内外因子的影响。根据基因表达性质可将其分为2大类：一是瞬时调控或称可逆性调控，包括某种底物或激素水平升降和细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节；二是发育调控或称不可逆调控，它决定了细胞生长、分化和发育的全部进程。根据基因调控在同一事件中发生的先后次序，又可将其分为转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控及蛋白质加工水平调控等。植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用的影响。植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5′端上游区的DNA序列，能指导全酶与模版的正确结合，活化RNA聚合酶，使之具有起始特异性转录的形式，并决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶类型，是转录调控的中心。因此，植物基因启动子的克隆，对研究植物基因表达调控和构建表达载体至关重要。 　　 　　1基因克隆方法 　　 　　通过对已发表的大豆基因的克隆方法进行比较分析后发现，其克隆策略可概括为2种：一种是用已知克隆作为探针筛选cDNA或gDNA文库，从而获得所需的靶基因序列，然后再选择合适的载体进行基因克隆测序。从基因组文库中克隆相对费时，但可获得较多侧翼序列。另一种则是采用PCR技术，即利用基因两端序列高度保守的特点，依据保守区序列设计引物，用PCR直接扩增基因组DNA，然后用Southern杂交和非整倍体材料进行定位，再亚克隆后测序。 　　 　　2克隆载体的构建 　　 　　植物基因转移的目的在于将目的基因导入需要改良的植物，使之正确而有效地表达，并将产生的目的性状以可预言的方式稳定遗传下去。然而目的基因片段很难直接转入植物细胞，而且由于它自身常无DNA复制所需信息，在细胞分裂时不能复制给子细胞，从而丢失，所以人们要把它连在一些能独立于细胞染色体之外复制的DNA片段上，这些DNA片段就叫载体。常用的载体有质粒和病毒。质粒是最常用的载体，它通常是DNA环状分子，可以独立地存在于细菌细胞中，而且质粒上总是有1个或多个可赋予宿主细胞以某些有用特性的基因，如质粒上的抗生素基因可以使宿主细胞在一定浓度的氯霉素或是氨苄青霉素等抗生素存在的培养基中存活。这些抗生素基因在克隆技术中常被用作选择标记（selectable marker），以选择和鉴定重组子。在基因克隆中使用最广泛而且结构最简单的载体一般都来源于较小的细菌质粒，如大肠杆菌中所存在的这种质粒载体，不仅易于纯化，转化效率高，选择重组子方便，而且可携带的外源目的基因的容量也较大（大约5kb）。因此，一些常规克隆实验都用质粒载体。质粒除了在细菌细胞中广泛存在外，其他细胞中并不普遍存在，如在真核细胞中仅发现极少的几种质粒，其中研究最深的是酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的2um环（2um circle），人们已经将其构建成了能在酵母中表达的载体，使基因工程的应用范围得以扩大。 　　为构建高效植物表达载体，人们需要对天然质粒及病毒进行一系列改造，如加上耐药性基因片段等，以提高基因转化、筛选、表达的效率。构建好载体后，将目的DNA片段与载体实现连接，形成全新的重组DNA分子，通过一定的方法导入受体植物细胞，便可能获得转基因植株。 　　 　　3报告基因的选择 　　 　　报告基因（reporter gene）是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其他目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：一是已被克隆和全序列已测定；二是表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；三是其表达产物能进行定量测定。 　　在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因（nos）、章鱼碱合成酶基因（ocs）、新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。nos、ocs这2个基因是致瘤土壤农杆菌（Agrobacteriu