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猪USF1基因克隆和序列分析 　　摘要：研究克隆了猪USF1基因1 382 bp的cDNA序列（登录号：EF 219407）和5 516 bp的DNA序列（登录号：EF 625885）。序列分析发现猪USF1基因编码区序列与人、小鼠的同源性分别为99%和98%。基因组序列分析发现猪USF1基因包含11个外显子和10个内含子，内含子的剪接方式均符合“GT-AG”法则。 　　关键词：猪；USF1基因；克隆；序列分析 　　中图分类号：S828；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）24-6175-03 　　上游刺激因子1（Upstream stimulatory factor 1，USF1）是螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链（HLH- LZIP）转录因子家族成员之一[1]，可以与USF2形成二聚体，并能识别DNA的E-box序列，调节基因转录[2]。人类USF1基因位于1q22-q23[3]，并广泛表达于机体的各个组织，调控糖和脂肪代谢基因的表达[4]，此外USF1基因还具有调节免疫反应和细胞周期的功能[5]。研究发现USF1基因可以作为调节治疗人的胰岛素抵抗葡萄糖不耐症、II型糖尿病和向心型肥胖易感症的候选基因[6-9]。本研究利用EST信息和测序的方法克隆了猪USF1基因并进行了序列分析，为进一步研究该基因对猪生长发育的调控机理具有重要的意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　采集4月龄大白猪（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所原种猪场）的肌肉组织，用液氮速冻置于 　　-70 ℃中，利用TRizol法提取总RNA，反转录得到cDNA。利用DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取DNA，贮存于-20 ℃。 　　pMD-18T vector system、DH5α购自宝生物工程（大连）有限公司；Gel Extraction Kit购自生工生物工程（上海）股份有限公司。 　　1.2 引物设计 　　以人的基因序列为探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank数据库中搜索同源序列，筛选猪的同源性EST（标准：长度≥200 bp，相似性≥80%），用DNAStar软件包中的SeqMan程序进行EST序列拼接，参照拼接的contig（重叠群）采用Primer5.0软件设计引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R等3对引物扩增USF1基因的cDNA序列。参照USF1基因的cDNA序列设计U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R，U9F/U9R等6对引物（表1）扩增USF1基因的序列。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 　　1.3 PCR扩增与测序 　　PCR扩增体系为25 μL，包括50 ng 模板DNA、2.5 mmol/L 1×Taq Buffer、1.5 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、0.5 mmol/L PCR primers、2 U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性45 s，退火（温度、时间根据引物来确定），72 ℃延伸90 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用Gel Extraction Kit试剂盒纯化回收，与pMD-18T vector system连接，并转化大肠杆菌DH5α，将阳性克隆送至北京奥科生物技术有限公司测序。 　　2 结果与分析 　　2.1 RT-PCR扩增USF1基因 　　以大白猪cDNA为模版，利用引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R均扩增出了特异带，RT-PCR扩增产物结果如图1所示。将PCR产物回收、纯化、克隆测序，测序结果显示引物U1F/U1R扩增产物长度为613 bp（图1a），引物U2F/U2R扩增产物长度为312 bp（图1b），引物U3F/U3R扩增产物长度为520 bp（图1c）。 　　2.2 猪USF1基因的cDNA序列同源性分析 　　利用DNAStar软件的SeqMan程序将RT-PCR扩增得到的片段进行拼接，得到一条长1 382 bp的 cDNA序列。将获得的猪USF1基因的cDNA序列分别与人USF1基因cDNA序列（NM_007122）和小鼠序列（NM_009480）进行比对。结果表明，猪与人、小鼠的同源性分别为99%和98%，确定所获取的序列为猪的USF1基因，提交到GenBank，得到登录号为EF 219407。 　　2.3 猪USF1与部分物种USF1的进化关系 　　利用GenBank已有的USF1蛋白质序列： NP_001001161（USF1，Cattle），NP_001007486（U