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金针菇菌丝和原基差异表达基因分析 　　以金针菇（Flammulina velutipes）1123菌株的单孢W23基因组为参考完成其菌丝和原基转录组测序与数据分析，研究两样本间差异基因，并对差异基因进行GO功能和KEGG Pathway显著性富集分析。结果表明：两个样本中共有显著性差异表达的基因 3310个，其中在原基中上调、下调的基因数分别为1686、1624个，只在原基中表达的基因有26个。GO功能分析结果表明，在原基中膜封闭腔、内膜系统、细胞器腔、核糖核蛋白复合体、翻译调节器、发育过程、免疫系统过程、多细胞生物过程这8个GO基本单元中的差异基因全部呈现上调表达。Pathway 功能富集分析结果表明，核糖体与DNA复制中的差异基因全部呈现上调表达，糖酵解途径中从D葡萄糖转化成丙酮酸过程相关的11个差异基因全部呈下调表达，磷酸戊糖途径中相关的13个差异基因中有11个基因呈下调表达。 　　原基； 差异基因表达； GO功能； Pathway分析 　　近年来食用菌生长发育机理研究进展迅速，目前研究发现温度、光照、CO2浓度以及湿度等环境因子等对食用菌子实体分化发育都存在不同的影响；外源添加物、有益微生物与食用菌子实体分化的关系也十分密切[1]。近年来，随着生物技术的发展，对食用菌发育分化的研究主要集中在发育相关酶学、发育基因以及蛋白质组学等方面[1]，如OHGA S等提取RNA检测漆酶基因（lcc1和lcc2） 转录物，发现其在菌丝定殖期最高而在子实体发育期锐减，说明漆酶与子实体分化发育相关[2]；YAMADA等通过定向差异显示和重组技术证明编码几丁质脱乙酰酶及其基因fv.Pda对金针菇子实体发育过程起着重要作用[3]；陈美元通过2DE技术获得了双孢蘑菇（Agaricus bisporus）子实体发育初期表达量有显著变化的14个蛋白质，其可能与子实体形成及发育密切相关[4]。目前，已有大量的食用菌基因序列和蛋白数据登录NCBI等公共数据库中，如裂褶菌（Schizophyllum commune）、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）和灰盖鬼伞（Coprinus cinereus）等都有大量的基因序列和蛋白数据公开[1]，为深入研究食用菌的分化发育奠定基础。 　　通常研究食用菌不同发育阶段的基因表达差异的方法是通过mRNA差异显示技术，需要经过采样、RNA 提取、反转录、差异显示PCR、片段回收、重扩增、克隆与鉴定、序列比对分析等。如季哲等用mRNA差异显示找到T11GB0322基因片段是黄伞在生殖生长阶段差异表达的基因片段[5]。该技术对实验条件要求高，但一次实验找到的差异基因并不多。 　　目前，转录组学（Transcriptomics）已成为研究细胞表型和功能的一个重要手段，已应用于食用菌的研究中。刘朋虎等对草菇的转录组分析表明，在菌丝形成原基的过程中葡萄糖、己糖和乙醇等代谢途径大部分基因下调表达，并找到在原基期特异表达的321个基因[6]。通过转录组学不仅可以在实验样品内纵向比较，也可通过公共数据横向比对，从而找到更多差异基因的数据，目前国内尚未报道金针菇（Flammulina velutipes）有关原基形成的转录组方面的研究，笔者对金针菇双核菌丝和子实体原基间差异表达的基因进行分析，以期发现与形成原基相关的基因，为金针菇及其它食用菌子实体发育机理研究提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1供试菌株 　　本研究所用菌株为金针菇（F. velutipes）双核菌株1123，由福建省食用菌种质资源保藏中心提供。 　　1.2参考基因组的来源 　　参考基因组为双核菌株1123分离得到的单孢菌株W23的基因组[7]。 　　由W23得到6GB数据量的FQ文件作为金针菇组织样品转录组测序的参考数据。该数据已由福建农林大学生命科学学院菌物研究中心上传到DDBJ/EMBL/GenBank （http：///）保存，其编号为：No.APH（BioProject：191864）。 　　1.3样品制备及RNA 提取 　　双核菌株1123菌丝的获取方法与出菇方法参照文献[7]。在接种1123菌株后第15天采集菌丝，用无菌密封袋收集；在1123菌丝扭结形成鱼子状大小的原基（图1）后，在24 h内用无菌解剖刀采集原基，并用密封袋收集；两种样品采集后立即放入液氮封存。菌丝及原基总RNA 提取方法参考OMEGA公司植物总RNA提取试剂盒说明书进行。用Agilent 2100 对提取总RNA 的浓度（ng/μL）、28S∶18S 及RNA 的完整性进行检测。 　　1.4转录组数据获得与数据匹配 　　将检测合格的RNA样品送至华大基因公司进行转录组文库构建与测序。 　　用c