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中医药治疗膝骨关节炎实验的研究及临床观察 　　【关键词】膝骨关节炎；中医药治疗 　　【中图分类号】R259 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2014）03-01290-01 　　膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种慢性关节疾病，以膝关节软骨退行性改变为核心。膝骨关节炎是我国四大老年病之一，根据我国流行病学研究发现人群的患病率为8.3%，占我国65岁以上人群所有慢性病的50%，国内一项调查显示，35至64 岁人群膝痛和KOA 的患病率分别为13.6 %和10.9 %【1】且以原发性最多见【2】。随着我国老龄化的加剧这一数据将逐步增长，严重的危害了中老年人的健康。根据多年经验总结出健骨方治疗膝骨关节炎，疗效满意，未见明显的毒副作用。 　　我们通过动物实验的方法采用TUNEL法检测软骨细胞的凋亡指数（AI）、PCNA法检测增殖指数（PI）；免疫组化方法测定关节软骨基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、特异性组织基质金属蛋白酶抑制因子（TIMP-1）的平均灰度来综合评价中药健骨方的治疗作用，为临床用药提供依据。具体方法如下： 　　1 材料 　　1.1 动物及药物 　　6月龄新西兰大白兔35只，体重（2.50±0.10）kg，在山东中医药大学第一附属医院动物房饲养。 　　中药： 　　左归丸：熟地2.75g，山药1.38g，枸杞1.38g，山茱萸1.38g，川牛膝1.03g，鹿角胶1.38g，龟板1.38g，菟丝子1.38g； 　　四秒散：苍术2.75g，黄柏2.75g，薏苡仁2.75g，怀牛膝2.75g； 　　?g桐丸：?g莶草2.75g，臭梧桐2.75g； 　　失笑散：五灵脂0.65g，生蒲黄0.65g； 　　健骨方：虎杖1.72g，骨碎补3.44g，土茯苓2.28g，土元2.28g，王不留1.38g，独活2.28g，川牛膝1.72g。 　　每日用量根据Meeh-Rubner 公式 A=K×W2/3×10-4，按成人体表面积与家兔体表面积换算。（按每只新西兰兔的每日剂量计算，每次购一周量水煎，4℃保存） 　　1.2 主要试剂 　　MMP-1、MMP -3、TIMP-1免疫组化检测试剂盒；原位细胞死亡检测试剂盒；3%戊巴比妥钠；生理盐水；甲醛；0.3%过氧化氢甲醇溶液；二甲苯和乙醇。 　　2 方法 　　2.1 造模方法 　　按照日本鬼头康彦等【3】的兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶造成膝OA病变模型方法。正常饲养1周后将除正常对照组以外各组兔右膝关节腔内注入1.6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5ml，隔3天，再注射第2次，共注射2次。 　　2.2 实验分组 　　按照随机和重复的原则，将35只新西兰兔随机分为7组，A组（正常对照组）、B组（模型对照组）、C组（左归丸组）、D组（四妙散组）、E组（?g桐丸组）、F组（失笑散组）、G组（健骨方组），每组5只。造模后即日开始灌胃给药，每日1次，每次8ml，共计8周。 　　2.3 观察指标 　　2.3.1 免疫组化法检测MMP-3、TIMP-1平均灰度。 　　2.3.2 TUNEL法检测软骨细胞凋亡指数（AI）。 　　2.3.3 PCNA法检测软骨细胞增殖指数（PI）。 　　3 结果 　　3.1 MMP-3、TIMP-1的图像定量分析 　　经Leica Qwin V3 图像分析软件分析，测定软骨、滑膜中MMP-3、TIMP-1平均灰度。 　　软骨、滑膜中MMP-3平均灰度方面：模型对照组与正常对照组比较均数增高，经统计学处理差异有统计学意义（P0.05），表明建模成功；健骨方组、左归丸组、四妙散组、失笑散组、?g桐丸组与模型对照组比较均数降低，经统计学处理差异有统计学意义（P0.05），表明以上各组可以通过降低软骨细胞中MMP-3平均灰度来改善软骨病变；健骨方组与其他各中药组比较均数降低，经统计学处理差异有统计学意义（P0.05），表明健骨方组在降低软骨、滑膜中MMP-3平均灰度方面优于其他中药组。软骨、滑膜中TIMP-1平均灰度方面：模型对照组与正常对照组比较均数增高，经统计学处理差异有统计学意义，表明建模成功；健骨方组、左归丸组、四妙散组、失笑散组、?g桐丸组与模型对照组比较均数增高，经统计学处理差异有统计学意义（P0.05），表明以上各组可以通过增高软骨、滑膜中TIMP-1平均灰度而改善软骨病变；健骨方组与其他各中药组比较均数增高，经统计学处理差异有统计学意义（P0.05），说明健骨方组在增高软骨、滑膜中TIMP-1平均灰度方面优于其他各中药组。结果见表1。 　　3.2 PCNA法检测软骨细胞增殖指数 　　软骨细胞增殖指数方面：模型对照组与正常对照组比较均数降低，经统计学处理差异有统计学意义（