人脑胶质瘤细胞体外多柔比星敏感性实验的研究.docVIP

人脑胶质瘤细胞体外多柔比星敏感性实验的研究 　　摘要：目的：探讨人脑胶质瘤体外培养后对多柔比星的敏感性，以期指导多柔比星对脑胶质瘤的间质化疗。方法：对脑胶质瘤手术后的组织进行原代细胞培养和纯化，采用MTT法进行多柔比星等多种化疗药物体外药敏试验。结果：对44例人脑胶质瘤手术标本进行体外培养及药敏试验，获得药敏结果38例，其体外药敏成功率86.4%。单用和联用多柔比星均对原代培养的脑胶质瘤细胞有较好的抑制作用，脑胶质瘤体外培养细胞对多柔比星单用或联合使用都有较高的敏感率，多柔比星化疗对复发脑胶质瘤细胞的敏感率较原发胶质瘤高。结论：MTT法体外药敏试验显示多柔比星对脑胶质瘤细胞有较好的抑制作用，并有较高的敏感率，适合用于脑胶质瘤的间质化疗。 　　关键词：脑胶质瘤；多柔比星；体外药敏试验；间质化疗 　　中图分类号：R739.41 文献标志码：A 文章编号：1008-2409（2016）03-0005-05 　　人脑胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤，由于其浸润性生长，且多位于脑重要功能区，使手术难以全切，放疗和全身化疗疗效有限，病死率及复发率高，给社会和病患家庭带来了巨大的精神负担和经济负担。近30年来，对脑胶质瘤的治疗仍然没有太多的进展。全身化疗作为脑胶质瘤综合治疗的手段之一，虽在临床广泛应用，但由于脑胶质瘤细胞本身对许多化疗药物耐药及血脑屏障的存在，导致脑胶质瘤全身化疗效果不理想。而间质化疗作为一种新的直接绕过血脑屏障的给药途径，正受到学者们的关注。非周期特异性、广谱且对脑组织无明显毒副作用的多柔比星在脑胶质瘤的间质化疗中已有明显效果。为进一步探索多柔比星对不同类型脑胶质瘤细胞的抑制作用，笔者应用多柔比星等多种化疗药物对脑胶质瘤细胞行体外药敏试验，以期指导临床应用多柔比星对脑胶质瘤的间质化疗。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 　　自2011年7月至2013年10月，对44例人脑胶质瘤手术标本采用MTT法行多柔比星等5种化疗药物行体外药敏试验。培养成功38例，其中男性22例，女性16例，年龄14～68岁，原发24例，复发14例，术后病理均证实为脑胶质瘤，按WHO（2007）神经上皮肿瘤分类标准进行的组织学分级：低分级（Ⅰ～Ⅱ级）20例，高分级（Ⅲ～Ⅳ级）18例。所有患者均行开颅显微肿瘤切除，术后标本予以细胞培养并行多柔比星等化疗药物敏感试验。 　　1.2脑胶质瘤细胞体外培养及药敏试验 　　1.2.1肿瘤细胞悬液的制备及细胞培养选取手术切除的新鲜肿瘤组织放人含有100 U/ml青霉素及100μg链霉素双抗RPMI-1640培养液（含10%小牛血清）中，2 h内送实验室。在实验室取出肿瘤标本，D-Hank’s液漂洗2～3次，去除血凝块及坏死组织，剪成约0.5～1.0 mm3组织小块，用D-Hank’s液漂洗数次至无血细胞，加入20～30倍组织量的0.25%胰蛋白酶，与组织混匀，旋盖，放入37℃水浴中消化10～30 min，不断摇动，使组织变白、疏松，吸出消化液，加入完全培养液，将已过滤的消化液1 200 rpm，低速离心5 min，弃上清，加入培养液RPMI-1640，轻轻吹打形成单细胞悬液。取少量单细胞悬液，接种于50ml培养瓶中，置于恒温保湿细胞培养箱中培养，然后纯化。脑胶质瘤纯化具体步骤如下：①吸除或倒掉培养瓶内旧培养液，用PBS液洗1～2次。②加0.25%胰蛋白酶1～2 ml，稍加摇动让胰蛋白酶流过所有细胞表面。③37℃恒温水浴消化1～2min，置于显微镜下观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大，部分脱壁后，即加入2 ml含有血清的培养液终止消化。④将消化好的混合液1200转/min，低速离心5 min后，去上清液，用含血清培养液制备细胞悬液，接种培养瓶。⑤培养10～20 min后，稍振荡培养瓶，吸出培养液，接种另一培养瓶。⑥再培养10～20 min后重复上步（第⑤步）。⑦重复上述步骤（第⑤、⑥步）2～3次即可。 　　1.2.2 MTT法药敏试验将纯化后对数生长期的脑胶质瘤细胞配置成浓度为5×105细胞悬液，加入96孔培养板，每孔180μl（含9×104个细胞1，培养24 h，实验组加入不同浓度的化疗药物20μl，每种药物设立3个浓度梯度（0.1×PPC、1×PPC、10×PPC），联合用药组加药浓度为各药半数有效浓度（IC50），在培养箱里让细胞与药物作用72 h。每孔加入20μl O.5%MTF[3-（4，5-dimethylth-iazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide噻唑蓝1液，继续培养4 h，去上清液，每孔加二甲基亚砜（DMSO）200μl，振荡器上轻轻振荡5～10 min，用酶联免疫检测仪于570 nm处测定各孔光密度值（OD值），取3孔OD值平均数