CCTCCM201021脂肪酶活力.PDFVIP

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2018-10-13 发布于湖北
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生物工程学报 Chin J Biotech 2009, December 25; 25(12): 1892-1899 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac.cn © 2009 Institute of Microbiology, CAS CSM, All rights reserved 研究报告 -PCR Rhizopus chinensis CCTCC M201021 王睿, 喻晓蔚, 沙冲, 徐岩 , 214122 : 运用定向进化- 易错PCR 的方法, 提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021 脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR 和p NPP 顶层琼脂法筛选, 从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株 1-11 和2-28, 脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2 倍和4 倍。基因比对结果表明, 突变脂肪酶2-28 有4 个氨基酸发生了突变: A129S、K161R 、 A230T 、K322R 。蛋白质分子空间结构模拟显示, 突变A129S 、K161R 、A230T 位于脂肪酶分子表面。突变A230T 增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变 K322R 处在 loop 上, 靠近脂肪酶底物结合区域, 与邻近的Asp( 带负电)形成盐桥。静电引力将该loop 向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引, 使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明, 突变株2-28 脂肪酶的Km 值比出发菌株下降了 10%, Kcat 值提高为原来的2.75 倍。 : 定向进化, 易错PCR, 华根霉脂肪酶, 脂肪酶活力 Increasing activity of Rhizopus chinensis CCTCC M201021 lipase by directed evolution-error prone PCR Rui Wang, Xiaowei Yu, Chong Sha, and Yan Xu Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education , Cencter for Brewing Science and Enzyme Technology, Jiangnan University , Wuxi 214122, China Abstract: Directed evolution strategy (error-prone PCR) was conducted to improve the activity of lipase from Rhizopus chinensis CCTCC M201021. Through two rounds of ep-PCR and p NPP top agar screening, two optimum mutant strains 1-11 and 2-28 were obtained with 2 and 4 fold of enzyme activity higher than that of parent strain, respectively. DNA sequencing of mutant lipase 2-28 revealed four amino acid substitutions: A129S, K161R, A230T, K322R