南海红树林内生真菌GX—3代谢产物的研究.docVIP

南海红树林内生真菌GX—3代谢产物的研究 　　摘要：采用反复硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20凝胶色谱法等分离纯化南海红树林内生真菌GX-3的代谢产物，并通过理化常数测定和光谱分析鉴定其化学结构。结果表明，从南海红树林内生真菌GX-3的菌体中分离得到6个代谢产物。经波谱解析，分别为：环（苯丙-甘）二肽（1）、环（丙-亮）二肽（2）、Fusaric acid （3）、3，6-di-sec-butyl-1，4-dihydroxypiperazine-2，5-dione（4）、环（脯-亮）二肽（5）、环（甘-亮）二肽（6）。初步药理活性显示化合物1对口腔癌细胞KB、KBv200的抗肿瘤活性的LD50值分别为6.5和11.2 μmol/L。通过鉴定，所有化合物均系首次从南海红树林内生真菌GX-3中分离得到。 　　关键词：红树林；内生真菌；代谢产物 　　中图分类号：O629 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）11-2558-04 　　海洋微生物资源由于具有可持续开发性，其活性物质生产不受天然资源难再生的限制，能通过发酵进行胞外生产，与现代微生物技术相结合，较容易实现工业化生产，特别是其生产不对环境造成危害，符合当今绿色化学发展的方向。而多数报道均显示海洋真菌都与红树林有着紧密的联系[1，2]，对红树林真菌生物活性物质的研究已成为海洋微生物资源开发利用，寻找天然药物先导化合物的重要途径。近十几年来，已有学者对中国南海红树林内生真菌进行了系统的研究，并从中分离获得了一系列结构新颖、药理活性良好的海洋天然化合物[3-9]。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器和试剂 　　美国Varian公司的INOVA-500NB超导核磁共振谱仪、INOVA-300NB核磁共振仪、VG ZAB-HS双聚焦质谱仪、Thermo DSQ电子轰击电离质谱仪和Thermo MAT95XP高分辨质谱仪；北京泰克仪器有限公司的X-4数字显示显微熔点测定仪。所用试剂均为广州化学试剂厂生产，化学纯，溶剂经重蒸后使用；柱层析硅胶为青岛海洋化工厂生产的200～300目硅胶，硅胶H，薄层硅胶GF254。 　　1.2 菌种培养 　　红树林内生真菌GX-3采自中国香港，经鉴定为拟茎点霉菌（Phomopsis sp.），保存于中山大学化学与化学工程学院。发酵培养基为葡萄糖10 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏1 g/L、粗海盐2 g/L、pH 7.0。500 mL三角瓶内装培养基200 mL，1.25×105 Pa 灭菌15 min后接种100 mL，在25 ℃静置培养30 d。分别收集发酵液和菌体。 　　1.3 提取与分离 　　100 mL发酵物过滤得菌体和发酵液，发酵液浓缩后用乙酸乙酯充分萃取，菌体用甲醇多次浸泡。提取浓缩物分别以体积比1∶2拌硅胶（200～300目）进行柱层析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇进行梯度加压洗脱。收集各组分再经反复柱层析，制备薄层层析，重结晶等方法进行纯化。从菌体粗提物（约20 g）分离得到环（苯丙-甘）二肽（1）（6 mg）、环（丙-亮）二肽（2）（8 mg）、Fusaric acid （3）（10 mg）、3，6-di-sec-butyl-1，4-dihydroxypiperazine-2，5-dione（4）（5 mg）、环（脯-亮）二肽（5）（10 mg）、环（甘-亮）二肽（6）（10 mg）。 　　1.4 细胞毒活性试验 　　采用MTT法[10]测定化合物1对人体口腔癌KB、KBv200的抗肿瘤活性。 　　1.5 化合物的试验数据 　　2 结果与分析 　　化合物1～6的结构图如图1所示。 　　化合物1：白色粒状晶体， FABMS显示分子离子峰为205[M+1]+， NMR结合质谱，得到分子式为C11H12N2O2。1HNMR中，δ 8.07 （brs， 1H）和7.80 （brs，1H）表明存在2个酰胺质子信号；δ 7.27 （m，3H）和7.17（m，2H）提示存在单取代苯环；δ 4.05 （dd，8.0，5.0 Hz，1H）说明存在连接杂原子的-CH；δ 3.09（dd，13.5，4.5Hz，1H）和2.89 （dd，13.5，5.0Hz，1H） 是苄亚甲基的特征；δ 3.36 （dd，17.5，3.0Hz，1H）和2.80 （d，17.5Hz，1H） mg/L的偶合常数相同，说明是连接杂原子的-CH2的2个同碳质子。根据这些信息推出该化合物为环（甘-苯丙）二肽。进一步与标准谱图及文献[11]对比得到确证。 　　化合物2：白色粉末，IR（KBr）νmax1 679、1 648/cm提示分子中存在酰胺键， 2个活泼氢8.09（brs，1H）， 8.00（brs，1H）证实了酰胺基