靶向树突状细胞ccr7反义肽核酸抑制大鼠肝移植急性排斥的实验研究-外科学(普外)专业论文.docx

华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 I I 靶向树突状细胞 CCR7 反义肽核酸抑制大鼠 肝移植急性排斥反应的实验研究 博士研究生 董胜利 导 师 裘法祖教授 赵浩亮教授 中文摘要 移植排斥反应实质上是受体免疫系统对供体移植物抗原的免疫应答，是 T 淋巴细 胞依赖的细胞性反应过程。但器官移植后受体的免疫系统并不能直接识别供体抗原， 供体抗原信息必须经过抗原提呈细胞传递给受体 T 淋巴细胞使之活化才能产生后续的 免疫应答。树突状细胞(Dendritic cells, DCs)是功能最强的抗原递呈细胞,唯有 DCs 才能有效激活初始 T 细胞,其在体内递呈抗原的过程是一个动态的迁移过程，携带抗 原信息的 DCs 从外周迁移到淋巴组织的 T 细胞区完成抗原递呈并激活初始 T 细胞。目 前认为外周 DCs 向淋巴组织的迁移动力主要通过淋巴组织趋化因子作用于 DCs 趋化因 子受体 CCR7 这条途径。因此，CCR7 成为一个理想的目标。肽核酸（peptide nucleic acid ,PNA）是一种新型的核酸类似物，由多肽骨架替代核酸中的磷酸核糖骨架并与 4 种碱基相连而成,能够按照碱基互补的原则识别相应的碱基序列。PNA 较寡核苷酸链具 有更高的特异性和亲和力,不易被蛋白酶及核酸酶降解，而且对机体无毒,从而成为更 有前途的反义反基因制剂。 目的 (1)通过建立大鼠原位肝移植急性排斥和免疫耐受动物模型，观察两组大鼠 肝移植后体内DCs的迁移动态变化并对其在移植排斥中的作用进行探讨。(2)设计靶向 趋化因子受体CCR7的反义PNA，分离、培养大鼠骨髓来源DCs，在体外观察反义PNA对 CCR7基因表达的下调作用及其对DCs趋化活性和凋亡的影响。(3)在上述动物模型和体 外实验的基础上，进一步研究体内应用反义PNA对大鼠肝移植急性排斥反应的影响， 并对其可能机制进行探讨。通过以上三部分实验，来阐明大鼠肝移植后DCs的迁移特 征及其在移植排斥反应中的作用，应用反义PNA下调CCR7基因表达，阻断DCs的定向迁 II II 移和抗原递呈，切断抗原信息与免疫系统的联系，从而为抑制移植排斥反应和诱导免 疫耐受提供一种新的策略。 方法 (1)采用改良 Kamada 两袖套法建立大鼠原位肝移植模型，分为两组：急性 排斥组，供体为 Wistar 大鼠，受体为 SD 大鼠；免疫耐受组，供受体同为 Wistar 大 鼠。于术后第 3、5、7 天切取移植肝组织及腹腔淋巴结(n=4)，依据肝脏病理学变化 诊断肝移植术后急性排斥反应，免疫组织化学染色法检测 DCs 在肝组织、淋巴结的动 态变化以及 T 细胞在淋巴结的活化增殖。(2)体外培养大鼠骨髓来源 DCs，设计靶向 CCR7 mRNA 翻译起始区的反义 PNA，以随机 PNA、空白组为对照处理 DCs，分别于 24h， 48h, 72h 后收集细胞，利用免疫细胞化学法、Western blotting 和逆转录聚合酶链 反应(RT-PCR)技术检测反义 PNA 对 CCR7 分子表达的影响,通过趋化实验和流式细胞术 检测 DCs 的趋化活性和凋亡率。(3)同上方法建立大鼠肝移植排斥模型，在供肝冷保 存时和肝移植术后应用反义 PNA，以随机 PNA、空白组为对照，观察大鼠术后生存时 间。于术后第 7、10 天取标本(n=4)观察肝功能变化和肝脏组织病理学改变，免疫组 化染色法检测淋巴结 DCs 数量变化以及 T 细胞的活化增殖。 结果 (1)急性排斥组大鼠术后第 5 天出现典型的急性排斥反应表现和肝组织病理 学改变，免疫耐受组大鼠术后无明显排斥反应表现，肝组织仅发生轻微的形态学变化。 急性排斥组大鼠肝组织 DCs 数量在术后第 3 天明显增多，于第 5 天达到高峰，第 7 天 则出现下降，淋巴结 DCs 数量从第 3 天开始明显增多，第 5 天、7 天持续上升，与免 疫耐受组相比差异有显著性。急性排斥组术后第 3 天即可观察到明显的 T 淋巴细胞活 化增值反应，先于肝组织病理学变化发生，而免疫耐受组未见明显的 T 淋巴细胞活化 增殖。(2)体外培养的大鼠骨髓来源 DCs 经 PNA 处理后，在 24h,各组 DCs 其 CCR7 表达 无明显差别。在 48h，反义 PNA 组 CCR7 蛋白表达水平明显低于对照组，而在 mRNA 水 平却无明显差别。在 72h，反义 PNA 组 CCR7 的表达在不同水平均明显低于对照组。趋 化实验和流式细胞术结果显示，在 48h 以后反义 PNA 组 DCs 趋化活性受到明显抑制， 凋亡率明显增加。(3)大鼠肝移植术后，反义 PNA 组与随机 PNA、空白组相比淋巴结 PAGE IV PAGE IV DCs 数量明显减少，T 细胞活化增殖受到显著抑制