商陆正丁醇部位醋制前后肠道毒性变化的研究.docVIP

商陆正丁醇部位醋制前后肠道毒性变化的研究 　　[摘要]为探索商陆毒性部位炮制前后对肠道毒性变化的影响，提取分离获得了商陆正丁醇毒性部位，在整体动物模型水平，灌胃给药后观察小鼠肠道肿胀程度，测定小鼠肠道不同部位的含水量及粪便的含水量，考察商陆正丁醇部位炮制前后对腹泻及肠道肿胀的影响；在细胞水平，采用MTT法，测定肠细胞HT-29，IEC-6的IC50，比较醋制前后商陆正丁醇部位的毒性变化。结果显示商陆正丁醇部位能够导致肠道肿胀，表现为引起十二指肠、空肠的水肿，且可导致粪便含水量增加引起腹泻，可抑制肠细胞HT-29，IEC-6增殖，表明其具有肠细胞毒性，对HT-29细胞的IC5014.59 mg?L-1，IEC-6 IC5043.77 mg?L-1；经醋制，小鼠肠道肿胀程度显著减弱，肠道和粪便的含水量明显降低，对HT-29和IEC-6的抑制作用减轻，对HT-29细胞的IC5058.51mg?L-1，IEc-6 IC5084.37mg?L-1。由此可知，醋制法具有降低商陆正丁醇部位的毒性作用。 　　[关键词]商陆；正丁醇部位；肠道水肿；腹泻；肠细胞增殖抑制；醋制减毒 　　中药商陆为商陆科植物商陆Phytolacca acinosaRoxb.或垂序商陆P.americama L的干燥根。商陆味苦、寒，有毒，归肺、脾、肾、大肠经。有逐水消肿，通利二便的功能。主治水肿胀满、二便不通。用于水肿尿少，腹水胀满，外治外伤出血、痈肿疮毒等。商陆药性峻猛，有大毒，可对胃肠道黏膜产生强烈的刺激，表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻，严重者可导致呕血、便血，故临床上需炮制后应用。商陆生品粉末可引起家兔眼结膜强烈水肿，提取液能够刺激巨噬细胞释放炎症因子，醋制后毒性明显下降。课题组前期研究发现商陆正丁醇萃取部位具有强烈的刺激性，是商陆的主要毒性部位。本实验建立整体及细胞水平的毒性评价模型，比较商陆正丁醇部位模拟醋制前后对肠道毒性的变化，为商陆醋制解毒机制的研究奠定基础。 　　1 材料 　　1.1 仪器与试剂 　　Spring-S15i超纯水发生器；KQ-500DE型医用数控超声清洗器；Rotavapor R-210旋转蒸发仪（BU-CHI）；HH-2K4二列四孔智能水浴锅（南京科尔仪器设备有限公司）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；Spectra Max 190酶标仪（美国AD公司）。石油醚（南京化学试剂有限公司）；二氯甲烷（南京化学试剂有限公司）；正丁醇（南京化学试剂有限公司）；二甲亚枫（南京化学试剂有限公司）；羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司）；胎牛血清（美国WISENT公司）；RPMI 1640培养液（美国Hyclone公司）；青链霉素混合液（无锡海硕生物有限公司）；生理盐水（南京小营药业集团）；镇江香醋（江苏恒顺醋业股份有限公司）；PBS缓冲液（Thermo公司）。 　　1.2 药材 　　生商陆饮片购自精华制药亳州康普有限公司（云南产，批号131201）。药材经江苏省食品药品检验所胡皓彬主任药师鉴定为商陆科植物美洲商陆商陆科植物美洲商陆P.americana的干燥根。 　　1.3 动物与细胞 　　ICR小鼠，雄性，体重18～22 g，由南京市青龙山繁殖场提供，动物许可证号SCXK（苏）2012-0004。HT-29，IEC-6均购自ATCC。 　　2 方法 　　2.1 样品的制备 　　取原药材1 kg，加8倍量70%乙醇回流提取2h，提取2次，合并乙醇提取液，提取液减压浓缩后先用石油醚、二氯甲烷萃取，再用水饱和正丁醇萃取，萃取液减压浓缩，得到正丁醇部位浸膏200g；取正丁醇浸膏50g，根据饮片炮制加醋量和浸膏的得率，加75 g食醋，100℃煮30 min，减压浓缩，蒸干，得到醋制后浸膏。取生商陆浸膏、醋商陆浸膏适量，加CMC-Na配置成质量浓度为108 g?L-1的混悬液用作高剂量组，加CMC-Na配置成质量浓度为10.8 g?L-1用作低剂量组。取醋适量配置成质量浓度为162 g?L-1作为醋制空白组。 　　2.2 商陆正丁醇部位醋制前后对小鼠肠道的影响 　　ICR小鼠按体重随机分为6组，每组8只，分别为空白组、醋制空白组、生商陆和醋商陆低剂量组（270 mg?kg-1，相当于临床日用剂量）、生商陆和醋商陆高剂量组（2 700 mg?kg-1，相当于临床日用剂量的10倍）。实验前将各组动物禁食不禁水24h。各给药组按0.025 mg?g-1灌胃给药，空白组给予同等体积的CMC-Na。3 h内收集各组小鼠粪便，称重后放入70℃烘箱1 h，记录干燥前后粪便的质量；3 h后小鼠脱颈处死，打开腹腔分离肠系膜，观察肠道整体膨胀程度，并在十二指肠、空肠、回肠、结肠处各取2～3 cm，称重后放入70℃烘箱1