呋喃唑酮代谢物单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析的方法.docVIP

呋喃唑酮代谢物单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析的方法 　　摘 要 本研究针对呋喃唑酮代谢物（AOZ），设计合成了系列半抗原，进一步通过偶联牛血清白蛋白（BSA）免疫Balb/c小鼠、细胞融合、筛选和亚克隆等过程成功获得了源于新颖半抗原H?3的具有高亲和力（亲和力常数6.68×10??10 ?L/mol）和高特异性（与其它功能类似物交叉反应小于0.1%）抗AOZ单克隆抗体。同时，基于设计合成的系列同/异源半抗原/包被抗原，考察了不同结构包被原对ELISA方法灵敏度的影响。另外，采用最佳的特征结构异源包被原H?5?OVA，建立了以对硝基苯甲醛（p?NP）为衍生剂的AOZ间接竞争ELISA（icELISA）和直接竞争ELISA（dcELISA）检测方法。结果表明：icELISA模式的AOZ检测IC??50?为0.503 　　?SymbolmA@ g/L，定量检测线性范围（IC??20?～IC??80?）为0.06～14.0 　　?SymbolmA@ g/L，检出限（IC??10?）达0.017 　　?SymbolmA@ g/L；dcELISA模式的AOZ检测IC??50?为1.19 　　?SymbolmA@ g/L，定量检测线性范围为0.14～23.6 　　?SymbolmA@ g/L，检出限为0.056 　　?SymbolmA@ g/L。两种方法对AOZ的检测灵敏度和定量线性范围均达到相关检测限量要求，可满足不同需求的实际样品检测。 　　[KH*3/4D][HTH]关键词 [HTSS]呋喃唑酮； 单克隆抗体； 酶联免疫法； 异源包被? 　　 　　[HT][HK] 　　[FQ（3?２,X,DY－Ｗ][CD15]? 2011?04?29收稿；2011?11?30接受? 　　本文系国家自然科学基金 （No、广东省科技计划项目 （Nos.2009B011300005，2010A090200084，2011A0902000029）和华南农业大学校长基金 （No.5100?K08198）资助? 　　* E?mail: ymsun@scau.省略[HT] 　　 　　1 引 言? 　　呋喃唑酮是一种硝基呋喃类药物，广泛应用于水产类和禽类养殖，其在体内代谢快速，主要以代谢物3?氨基?2??ＧＦＤＡ１?唑烷酮（AOZ）形式存在，具有一定毒性、致畸性、致癌性，对人体健康与生态平衡具有潜在威胁??\[1,2\]?。因此，欧美等多国禁止其在动物生产中使用，我国农业部自2002年规定动物源性食品中呋喃唑酮不得检出??\[3\]?。? 　　目前，对食品中硝基呋喃类药物残留检测方法主要有HPLC， HPLC?MS/MS等仪器法??\[4,5\]?，该类方法灵敏、准确，但存在前处理繁琐、操作复杂、检测成本高的问题，难以满足现场大批量样品快速检测要求。近年来，基于抗原抗体反应的ELISA等快速免疫分析方法以其特异性强、灵敏、简便、准确和样品通量高等优点，弥补仪器法的不足，成为农兽药残留快速筛查的热点技术方法??\[6～8\]?。Cooper等于2004年首次制备了呋喃唑酮代谢物的多克隆抗体，对虾组织样品中AOZ的检出限为0.3 　　?SymbolmA@ g/L??\[9\]? ；Liu等报道了多克隆抗体检测ELISA方法, 检出限为0.05～12.15 　　?SymbolmA@ g/L??\[10\]?。多克隆抗体批间差异大，不利于开发性能稳定的快速检测产品，因而开发可弥补多克隆抗体不足的单克隆抗体已成为发展趋势。Diblikova等在呋喃唑酮代谢物单克隆抗体基础上建立了定量检测范围达到0.05～5 　　?SymbolmA@ g/L的ELISA方法??\[11\]?。另外，由于AOZ分子太小，难以直接检测，必须采用衍生化增加分子量方法实现间接检测??\[9～11\]?。本研究以对硝基苯甲醛（p?NP）为AOZ衍生试剂，基于新设计合成的系列半抗原，制备筛选获得了高特异性、高亲和力抗AOZ单克隆抗体，并在考察了不同结构包被原对ELISA方法灵敏度的影响基础上，采用最佳的特征结构异源包被原，建立特异、灵敏、稳定的AOZ间接竞争ELISA（icELISA）和直接竞争ELISA（dcELISA）检测方法，为进一步开发可满足实际样品不同检测需求的直接和间接竞争ELISA试剂盒奠定基础。2 实验部分? 　　2.1 仪器与试剂? 　　MK3多功能酶标仪（Thermo公司）；HP1100液相色谱?质谱联用仪（Agilent公司）；DRX?600核磁共振仪（Bruker公司）；UV?1640A紫外?可见扫描仪（Kyoto公司）；二氧化碳培养箱（Shell?Lab）；6K?15高速冷冻离心机（Sigma公司）；XSB?1A